folin酚法测定蛋白质含量.docx

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folin酚法测定蛋白质含量

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

第一实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则

1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。

2．进入实验室必须穿白大衣。

严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。

不得高声说话。

严禁拿实验器具开玩笑。

实验室内禁止吸烟、用餐。

3．严格按操作规程进行实验。

实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。

4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。

5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。

6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。

7．注意水、电、试剂的使用安全。

使用易燃易爆物品时应远离火源。

用试管加热时，管口不准对人。

严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。

任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。

8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。

废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。

9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。

实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。

实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。

10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。

值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。

离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。

实验名称

（TitleofExperimetn）

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

实验日期

（DateofExperiment）

实验地点（LabNo.）

合作者（Partner）

指导老师（Instructor）

总分

（TotalScore）

教师签名（Signature）

批改日期

（Date）

【实验报告第一部分（预习报告内容）：

实验原理、

实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、

实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：

】

一、实验原理

1921年，Folin首创Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应；1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。

Folin-酚试剂法主要包括两步：

第一步双缩脲反应

在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。

第二步Folin-酚显色反应

Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。

由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸（Tyr），故有此显色反应。

即蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。

另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。

二、实验材料

（一）样品

健康人血清（稀释300倍）

（二）试剂

1．牛血清白蛋白标准液（200g/ml）

准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250ml。

2．碱性硫酸铜溶液

①碱溶液：

Na2CO32g溶于100ml0.1mol/LNaOH中。

②硫酸铜溶液：

CuSO4∙5H2O0.5g溶于100ml35mmol/L（1%）酒石酸钾钠中。

使用前将①与②按50:

1混合即成碱性硫酸铜溶液。

使用时新鲜配制。

3．Folin-酚试剂

在2L磨口回流装置内加钨酸钠（Na2WO4∙2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4∙2H2O）25g，蒸馏水700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后用小火回流10h。

冷却后，再加硫酸锂（Li2SO4∙H2O）150g，水50ml，数滴（2~3滴）液体溴（也可用30%H2O26~8滴代替），然后开口沸腾15min，驱除过量的溴（因溴气甚毒，这一步应在通风橱中进行），冷却后加水至1000ml，过滤，溶液呈黄色（如带绿色则不能用），保存于棕色瓶中置冷暗处备用（如配制时间较长，试剂转呈绿色），可再加液体溴数滴，煮沸15min，若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用）。

（三）仪器及器材

1．V-1100分光光度计

2．恒温水浴箱

3．试管6支、试管架

4．加样枪、加样枪架

5．坐标纸

三、实验步骤

1．反应体系设置

↓

取6支试管编号，按下表加入试剂，混匀。

试剂（ml）

空白管

标管

样品管

1

2

3

4

5

6

牛血清白蛋白标准液

—

0.2

0.4

0.6

0.8

—

样品液

—

—

—

—

—

0.5

蒸馏水

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.5

2．双缩脲反应

向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2ml，混匀，室温放置10min

3．Folin-酚反应

↓

再加入Folin-酚试剂0.20ml,2s内迅速混匀a！

40℃水浴10min后，冷却至室温。

a.当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

4．比色测定

以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度值A500b。

b.每管重复测三次A500值，求平均值用于绘标准曲线。

【实验报告第二部分（实验记录）：

主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；

实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；

原始实验数据。

评分（满分20分）：

XX】

一、主要实验条件

实验条件见第一部分。

注意事项

1．干扰物质

此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin-酚反应。

此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。

而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。

若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。

若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。

2．控制时间

因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。

即第1支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。

全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mlFolin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mlFolin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。

40℃水浴10min，冷却后，每一分钟测定一管吸光值。

操作问题及处理

问题

解析

（1）

加入Folin-酚试剂后溶液呈现黄绿色

加入Folin-酚试剂后没有及时混匀或加入的量不准确，偏多

（2）

水浴后溶液呈无色

Folin-酚试剂在反应前已被破坏，原因是加入Folin-酚试剂后没有及时混匀，或水浴时间过长。

二、实验现象

1、加入Folin-酚试剂后溶液呈现蓝色，其中空白组蓝色较浅，标准管2~5蓝色依次加深。

三、实验数据

1．数据记录

按照下表记录各管在500nm波长测得的吸光度值。

测定次数

各管吸光度值A500

2

3

4

5

6

1

0.279

0.468

0.629

0.720

0.153

2

0.282

0.463

0.628

0.718

0.149

3

0.277

0.456

0.624

0.718

0.150

各管平均值

0.279

0.462

0.627

0.719

0.151

2．绘制标准曲线

3．结果计算

血清蛋白浓度（g/ml）=样品蛋白质浓度×2×300

线性方程为：

y=0.005x，将样品溶液（即6号试管）的吸光度（0.151）代入方程，就可得出样品浓度X=18.2g/l

即该样本中人血清蛋白浓度为18.2g/L,低于正常人平均值。

（参考：

正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L）。

【实验报告第三部分（结果与讨论）：

结果（定量实验包括计算）：

应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；

讨论：

不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。

结论：

简单扼要，说明本次实验所获得的结果。

（包括思考题）。

评分（满分45分）：

XX】

一、结果

1.实验测得的人血清蛋白浓度为18.2g/L，较标准值低。

二、讨论

本实验测得样本人血清蛋白浓度偏低，原因可能有：

1、样本人体较正常人体蛋白浓度偏低

2、Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，试剂被还原影响实验结果

3、读数、试剂加入时间不够精确

4、分光光度计溶液管表面油渍、污秽较多影响对光波长的分析

三、结论

1.实验测得的人血清蛋白浓度为18.2g/L，较标准值低。

课后思考题

1、试述Folin-酚试剂法的优点？

　　　Folin-酚试剂法较双缩脲反应灵敏，可以达到μg级别，操作方便，实验重复性好。

2、应用本方法有哪些干扰作用？

为什么？

应如何注意？

酸碱性干扰。

Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，而反应试剂是碱性的，所以将Folin试剂加入碱性的铜和蛋白质溶液中必须立即混匀，此反应只在极短时间内有效进行，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰反应。

酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

干扰物质过多时，可做矫正曲线进行修正。

因此使用这种方法进行检测的时候应该控制溶液酸碱性，严格把握添加试剂的时间，控制干扰因子，保证最有效的反应结果。