石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用.docx

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用.docx

《石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用.docx（11页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用

摘要

通过研究石榴病株的根际土壤细菌的生物学特性，分子鉴定，探索不同菌株对石榴枯萎病菌生长的影响，寻找有效的生防菌株，为石榴枯萎病的防治提供新的有效途径。

提取根际土壤中分离得到12种不同细菌菌株的DNA，利用其rDNAITS区段进行16SRNAPCR扩增进行分子鉴定；对云南省蒙自市新安所镇石榴枯萎病病枝进行分离纯化得到单一的石榴枯萎病菌，并观察其在12种土壤细菌菌液抹匀的PDA上的生长情况。

结果表明，编号为PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009,PSBS011的土壤细菌和枯草芽孢杆菌的同源性高达98%，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillussubtilis），并对石榴枯萎病菌有较好抑制作用。

关键词：

石榴枯萎病；枯草芽孢杆菌；土壤细菌；分子鉴定；抑制。

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用

1引言

石榴,别称安石榴。

为石榴科木本植物。

石榴是云南省蒙自最著名的特色水果，栽培石榴历史已有七百余年，以前仅在房前屋后零星种植，1987年引入世界银行贷款后，蒙自县开始发展石榴。

通过政策引导、资金扶持、技术研发与指导、基础设施建设以及市场开拓，到2007年石榴种植面积发展到11.19万亩，投产面积7.29万亩，实现产量9.5万吨，产值2.65亿元。

2008年新植2500亩，全县面积发展到11.44万亩，投产面积8.3万亩，预计产量10.8万吨，产值3.2亿元。

石榴是蒙自一种重要的经济果树[1]，蒙自县新安所镇产的甜石榴果实具有色泽艳丽，粒大皮薄，肉厚核软，汁多味甜等特点,是我国石榴中难得的佳品。

蒙自石榴还具有萌芽开花一早、果实成熟早的优势。

蒙自甜石榴以其独特的品位在我国石榴市场上占有绝对优势地位，每年农历七月至九月是蒙自石榴鲜果成熟上市的最佳季节，产品远销国内28个省（市、区）及越南、俄罗斯等6个周边国家。

石榴还有广谱抗菌的作用,石榴皮中含有多种生物碱，其对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等有明显的抑制作用，其中对志贺氏痢疾杆菌作用最强，石榴皮水浸剂在试管内对各种皮肤真菌也有不同程度的抑制作用，具有很高的经济价值[2]。

随着石榴种植规模的逐渐扩大，石榴病害日益严重。

石榴上常见的病害有石榴果腐病[3]，石榴干腐病[4]，石榴褐斑病[5]等。

近年来，由甘薯长喙壳引起的石榴枯萎病相继在印度、中国出现，并在短期内造成石榴植株大片枯死，严重影响了石榴的生产和发展，造成了巨大的经济损失。

根据甘薯长喙壳菌目前国内外的研究概况，从石榴生产的实际出发，采集云南省蒙自市新安所镇的发病石榴的枯萎病标样，进行分离培养，鉴定；并对石榴枯萎病根际土壤细菌进行分离、纯化，得到不同的细菌菌株，提取DNA，采用16sRNA通用引进行PCR扩增,再进行测序，到NCBI网站进行比对，最后确定为何种细菌；本研究旨在探索石榴根际土壤细菌的分离和形态分子鉴定及其病原菌在不同菌株菌液环境和不同菌株菌液的不同浓度下的生长特性，寻找有效的生防菌株，为该病菌的防治提供新的有效途径。

目前，随着石榴种植规模的不断扩大，石榴枯萎病影响了石榴的生产，造成石榴生产的经济损失。

甘薯长喙壳CeratocystisfimbriataEllis.etHalsted引起的石榴枯萎病1990年首次在印度的Bijipur地区发生，至1993年已蔓延整个Karnataka地区。

石榴园中病株年平均死亡率达7.5%。

2001年在云南省蒙自县相继发生石榴枯萎病[6]，经作者刘云龙分离鉴定以及致病性测定，证明病害是由甘薯长喙壳引起的，为国内果树新病害。

有关研究报道，茶枝小蠹虫Xyleborusfornicatus可能是石榴枯萎病的传播媒介之一。

对于石榴枯萎病的防治，2002年黄琼[7]、刘云龙等相继报道了云南石榴枯萎病，2005年毛忠顺等报道了化学杀菌对石榴枯萎病菌的抑制作用，此后，邓吉[8]等报道了氟硅唑等化学农药对石榴枯萎病菌有较好作用。

但是，截止目前未见对石榴枯萎病菌有较好抑制作用的生防菌株的报道。

在国外，石榴枯萎病仅在印度有报道。

1993年，印度开始发现石榴枯萎病，1999年Y.M.Somasekhara.报道了石榴枯萎病[9]；2000年，发现石榴枯萎病蔓延的比较快，同年他报道该病可能会影响到石榴种植业的发展；2002年研究发现枯草芽孢杆菌对石榴枯萎病菌有抵制效果，但未在田间大规模应用；2006年，筛选出了对石榴枯萎病有较高抗性的石榴品种，同年，报道了在马哈拉施特拉邦、卡纳塔卡、安得拉三个邦都有石榴枯萎病发现，发病率从0.74－8.14%不等；其间相继报道了石榴园常用除草剂对石榴枯萎病菌的影响[10][11]，草甘膦、乙氧氟草醚和百草对石榴枯萎病菌有较强的抑制作用。

2011年，汤东生[12-16]等报道了杂草协调枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis对石榴枯萎病菌有一定抑制作用。

但其生防菌株也不是来自当地，因而从当地病土中分离得到的不同细菌菌株，利用菌液提取DNA，再把产物进行PCR，进行分子鉴定；以云南省蒙自市新安所镇石榴枯萎病病枝进行分离纯化得到单一的石榴枯萎病菌，观察石榴枯萎病菌在不同菌株的菌液抹匀的PDA上的生长情况，以期得更好的结果。

2材料与方法

2.1试验时间、地点

2.2试验材料与仪器

2.2.1标本采集

2011年3月在云南省蒙自市新安所镇的发病石榴园调查发病植株症状、采集发病的石榴的枯萎病枝、病茎及健康植株组织标样、石榴病株的根际土壤。

使用发病石榴的病茎、病枝病健交界植株组织进行分离、培养得到石榴枯萎病病菌样本。

将采集的发病石榴的根际土壤，进行细菌分离、纯化，得到不同的细菌菌株。

2.2.2材料与药品试剂

土豆，葡萄糖，BIOWESTAGAROSE，次氯酸钠，氢氧化钠，浓盐酸，去离子水，石蜡油，蛋白酶K（20mg/ml），土壤基因组DNA快速提取离心柱形（北京百泰克生物技术有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒离心柱形（北京百泰克生物技术有限公司），真菌提取试剂盒柱式（AndyBio），16SRNAPCR扩增试剂。

2.2.3实验仪器

恒温培养箱，摇床，冰箱，培养皿，接种针，7.0mm的打孔器，滤纸，直尺，玻棒，培养皿，三角烧瓶，试管，酒精灯，5cm3指形管，高压灭菌锅，记号笔，酸度显示器，电子显微镜，载玻片，盖玻片，血球计数板，移液枪，DYY-6C型电泳仪，数显恒温水浴锅，日立台式冷冻离心机，AB＆9902PCR仪。

2.3试验方法

2.3.1石榴枯萎病菌的分离

用清水将病健交界植株组织冲洗干净，用灭菌手术刀取病变维管束组织3×4mm大小，经75%酒精溶液消毒,再用次氯酸钠溶液消毒,用灭菌水漂洗三次,用灭过菌的过滤纸吸干水后移到PDA培养基,置于25℃的恒温培养箱培养。

从菌落边缘挑取菌丝移植于PDA培养基平板上，再从移植的菌落边缘挑取菌丝，移入另一PDA平板上，重复上述操作直到获得纯菌落[17]。

将纯化的病菌移到PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱培养。

并对其进行形态及子鉴定。

将在PDA平板上纯化培养的菌丝体移入PDA斜面，25℃恒温培养箱培养10d，备用。

2.3.2土壤细菌的分离

称10克石榴根际土壤于无菌250ml锥形瓶中，用已灭菌的量筒量取无菌水定容至100mL，振摇约20分钟，使土样与水充分混匀。

无菌操作台上，在酒精灯火焰附近用无菌移液枪从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中，均匀混合，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。

然后用无菌移液枪分别由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已经编号的稀释平板中，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温静置10分钟，使菌液吸附进培养基。

25℃恒温培养箱培养3天[18]。

观察菌落特征，从稀释度合适的培养平板上挑取每一菌落各在不同的平板上划线分离，并进行编号，再进行纯化，得到不同的细菌菌株。

2.3.3土壤细菌的DNA提取

取500ul菌液离心（10000rpm，1分钟），弃上清；加入200ulRB溶液再离心（10000rpm，30秒），弃上清；重悬于200ulRB，加入200ulCB溶液，剧烈充分混匀；加入40ul蛋白酶K（20mg/ml）,70℃水浴10分钟；冷却后加100ul异丙醇剧烈混匀，溶液和絮状沉淀加入吸附柱AC中，离心（10000rpm,30秒）弃废液；加入500ulIR溶液离心（12000rpm，30秒）弃废液，加入700ulWB溶液离心（12000rpm,30秒）弃废液，加入500ulWB溶液离心（12000rpm,30秒）弃废液；将吸附柱AC放回收集管中，离心（13000rpm,2分钟），把AC放入一个干净离心管，在AC附膜的中间部位加入100ulEB（事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，离心（12000rpm,1分钟）；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，离心（12000rpm,1分钟）；检测DNA的浓度，取少量样品跑电泳[19]。

产物的琼脂糖凝胶检测，称取2g琼脂糖于100ml0.5×TBE中，加热溶解，冷却至65℃左右再加入终浓度为0.5%-1.0%的EB；电泳胶模两端用透明胶带封固，梳子至于适当位置，将冷却至65℃左右的琼脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3mm。

静置，待胶凝固后揭去胶模两端的透明胶带，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液小心拔出梳子。

将3ul提取的细菌DNA样品，与等体积溴酚蓝指示剂混匀，加入凝胶点样孔内，防止产生气泡和样品溢出[20]。

将电泳槽通电，80V恒压电泳90分钟。

电泳完毕，关掉电泳仪，小心取出凝胶置于紫外灯下观察结果，DNA条带橙绿色荧光。

2.3.4土壤细菌的16SRNAPCR扩增

引物设计[21]，引物由生工生物工程有限公司合成

扩增体系为25ul体系[22]，

扩增程式

产物的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3.5扩增产物的测序与分析

扩增产物交由华大基因公司测序。

将测序结果进行NCBI比对，采用DNAmanV6遗传距离分析，初步鉴定编号PSBS001，PSBS003，PSBS008，PSBS009，PSBS011菌为芽孢杆菌属。

2.3.6土壤细菌对石榴枯病菌的抑制作用

根据菌落形态及其分子生物序列鉴定的结果，初步鉴定了编号PSBS001，PSBS003，PSBS008，PSBS009，PSBS011菌为枯草芽孢杆菌。

并进行抑菌试验。

用PDA培养基（土豆200g，琼脂20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml），用土壤细菌进行血球计数板计数制得200vl分别带有103、104、105个细菌的菌液，并用移液枪吸取到平板上抹匀，用直径为7.0mm的打孔器取石榴枯萎病病菌菌饼接种到PDA平板培养基上正中，每个处理10皿，对照10皿，每个培养皿培养基基本一致，每1000ml倒50皿，置于25℃恒温培养，每24h观察并去除被污染菌落的培养皿，直到第10天观察菌落形态并测定菌落两个相互垂直直径。

抑菌公式算法为：

抑菌率（%）=100*[（Dck）2-（DT）2]/（Dck）2。

（Dck）2为对照菌落直径的平方，（DT）2为处理菌落直径平方。

采用SSR法进行多重比较结果。

3结果与分析

3.1提取DNA的检测结果与分析

图1为提取DNA的琼脂糖凝胶检测结果，由左到右编号依次为PSBS001，PSBS002，PSBS003，PSBS004，PSBS005，PSBS006，PSBS007，PSBS008，PSBS009，PSBS010，PSBS011，PSBS012。

由图1可以看出12种土壤细菌均提出DNA，但是编号为PSBS007，PSBS008，PSBS009，PSBS010浓度低，所以条带较弱。

均可进行16SRNAPCR扩增。

图1DNA提取结果

Figure1TheresultsofDNAextraction

3.2扩增产物的检测结果与分析

图2为PCR检测结果图，由左到右编号依次为PSBS001，PSBS002，PSBS003，PSBS004，PSBS005，PSBS006，PSBS007，PSBS008，PSBS009，PSBS010，PSBS011，PSBS012，MK。

由图2可以看出所有细菌PCR均有产物，且和最右边的MK比较得出其大小约为400bp。

可以送检测序。

图2PCR检测结果

Figure2TheresultsofPCR

3.3扩增产物的测序结果与NCBI数据库分析

因为枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，因此选择枯草芽孢杆菌作为标准菌株。

而测序的目标片段为400bp左右，所以选择已发表的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisstrainTAD169（GenBank:

FJ225312.1）的序列作为标准，其序列如下：

图3表明PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009,PSBS011和枯草芽孢杆菌BacillussubtilisstrainTAD169（GenBank:

FJ225312.1）同源性高达98％，根据序列比对同源性相似性99％以上，鉴别为相同种；小于99％而大于95％，鉴别为相同属；小于95％则被鉴别为同科[23]。

因此PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009,PSBS011同为芽孢杆菌属。

图3NCBI数据库分析获得的同源树

Figure3ThehomologytreeobtainedbyNCBIdatabaseanalysis

3.4土壤细菌对石榴枯病菌的抑制作用

由表1可以看出在12种土壤细菌的不同浓度PDA培养基上，培养10d石榴枯萎病菌菌落形态和直径有很大差异。

在103个菌浓度下，编号为PSBS001，PSBS003，PSBS008，PSBS009，PSBS011，PSBS012土壤细菌对石榴枯萎病菌的抑菌率在94%以上，有很强的抑制作用。

其中PSBS001，PSBS003，PSBS008，PSBS009，PSBS011为芽孢杆菌属。

在104个菌浓度下，12种土壤细菌的抑菌率几乎都在90%以上，对石榴枯萎病菌有较强的抑制作用；在105个菌浓度下，12种土壤细菌的抑菌率几乎都在95%以上，对石榴枯萎病菌有很强的抑制作用。

由此看出随着初始细菌个数增加到104、105个时，单一菌种的抑菌率逐渐增大，但是在相同初始细菌个数的不同菌种之间抑菌率差别不大。

所以在初始细菌个数增加到104、105个时，其抑菌率与细菌的种类无关，只与其初始细菌个数有关。

表1土壤细菌对石榴枯病菌的抑制作用

Table1TheInhibitionofSoilbacteriastothepathogesofpomegranatewilt

注：

当显著水平α=0.05用小写字母表示，当显著水平α=0.01用大写字母表示多重比较结果。

4讨论

石榴枯萎病是云南蒙自县的一个重要病害，该病已经影响了石榴产业的发展。

从1999年印度开始报道到现在，该病已经陆续在中国云南蒙自县和四川攀西地区发现。

该病是一种毁灭性的病害，自发现以来研究人员进行了化学防治、生物防治和生态调控研究，2005年毛忠顺等报道了化学杀菌剂对石榴枯萎病菌的抑制作用，此后，邓吉等报道了氟硅唑等化学农药对石榴枯萎病菌有较好作用,但是减少农药的使用量或者不使用农药是作物有害生物管理的目标[24]。

研究表明，杂草协调枯草芽孢杆菌对石榴枯萎病菌有一定抑制作用[14-16]。

然而，研究中所用的枯草芽孢杆菌是一个外源生防菌，既非石榴根、茎、枝、叶的内生菌，也不是来自石榴根际土，因此，其抑菌作用及其生防效果受到一定的限制。

本研究分离并纯化了石榴枯萎病株根际土壤中的细菌，利用分子生物学技术鉴定了分离得到的细菌，其中五个菌株为芽孢杆菌属细菌。

这为将来开发生防菌提供了菌种资源，也为生态控制石榴枯萎病奠定了基础。

然而，时间有限，未能开展更为深入的土壤细菌的生理生化试验。

若要将这五个菌株利用于生产实践，还有待于进一步的研究。

5结论

在103个细菌条件下编号为PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009,PSBS012对石榴枯萎病菌有较好抑制作用，抑菌率都在94%以上。

其中PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009是芽孢杆菌属。

随着初始细菌个数增加到104、105个时，单一菌种的抑菌率逐渐增大，但是在相同初始细菌个数的不同菌种之间抑菌率差别不大。

所以在初始细菌个数增加到104、105个时，其抑菌率与细菌的种类无关，只与其初始细菌个数有关。

参考文献

[1]罗雁,倪忠泽,龚秀萍等.蒙自石榴产业现状及发展对策[J].中国果业信息,2006,1:

5-9.

[2]陈栓虎等.从石榴皮中提取单宁的最佳工艺条件研究[J].精细化工,1996,13:

60-62.

[3]李夷波,冯光荣.蒙自地区石榴果腐病的发生及防治[J].植保技术与推广,1996,16

（2）:

24-25.

[4]梁家燕,商崇远.石榴干腐病和黑斑病研究初报[J].中国南方果树.2001,30

（2）:

49.

[5]张钦书,孟庆喜,周海波等.石榴主要病虫害及防治措施[J].植物保护,1989,5:

55.

[6]刘云龙,何永宏,王新志.国内一种果树新病害-石榴枯萎病[J].植物检疫,2003,17（4）:

206-208.

[7]黄琼,卢文洁,范金祥等.云南发现石榴枯萎病[J].植物病理学报,2004,34

（1）:

95-96.

[8]邓吉,刘书晓.石榴主要病虫害防治[J].河北果树.2002,

（1）:

33-34.

[9]Somasekhara,Y.M.NewrecordofCeratocystisfimbriatacausingwiltofpomegranateinIndia[J].Plantdisease,[St.Paul,Minn,AmericanPhytopathologicalSociety],1999,83（4）:

400.

[10]孔建,王文夕,赵白鸽等.枯草芽孢杆菌B-903菌株的研究Ⅰ.对植物病原菌的抑制作用和防治试验[J].中国生物防治.1999,17（4）:

157-161.

[11]毛忠顺,黄琼,王云月等.化学杀菌剂对石榴枯萎病的室内抑制作用[J].吉林农业大学学报,2005,27

（2）:

137-139.

[12]汤东生,但朝辉,毛忠顺等.植物叶片提取物对枯草芽孢杆菌抑制石榴枯萎病菌的反应[J].中国农学通报.2011，27（6）:

193-196.

[13]汤东生,王斌,毛忠顺等.大蒜根系分泌物对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌的作用[J].安徽农业科学.2011,39（9）:

5294-5296.

[14]汤东生，王斌，毛忠顺等.大蒜根系分泌物对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌的作用初探[J].农业科学与技术:

英文版.2011,12

（2）:

237-240.

[15]汤东生,王斌,毛忠顺等.石榴园常用除草剂和杀菌剂对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌生长的影响[J].江苏农业科学.2011,（5）:

154-156.

[16]汤东生,王斌,李成云.紫茎泽兰对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌生长的影响[J].杂草科学.2011,29（4）:

224-27.

[17]李倩,邓吉,杨敏等.引起石榴枯萎病和甘薯黑斑病的甘薯长喙壳菌菌株生物学特性的比较研究[J].菌物学报,2009,28

（2）:

189-196.

[18]李其帅,林志军等.土壤中解磷细菌的分离纯化（硕士研究生学位论文）[D].山东:

山东大学.2005.

[19]沈德新,封志纯,杜江.细菌DNA提取方法比较[J].中原医刊.2004,31（10）:

20-22.

[20]黄永莲.琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J].湛江师范学院学报.2009,30（6）:

83-85.

[21]秦睿玲,张西臣,田宗成等.犬贾第虫核糖体16sRNA部分序列克隆及测定[J].热带医学杂志.2002,4:

324-326.

[22]FelskeA,EngelenB,NubelU,etal.Sequenceheterogeneitiesofgenesencoding16SrRNAsinpaenibacilluspolymyxadetectedbytemperaturegelelectrophoresis[J].JBacteriol,1996,178:

5636-5643.

[23]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].黄培唐,王嘉玺,朱厚础,等译.北京:

科学出版社,2002,461-512.

[24]郭予元.我国农作物有害生物发生和防治研究概况[J].农药.1998,37（12）:

1-3.