RTPCR的具体步骤.docx

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RTPCR的具体步骤

RT-PCR实验步骤

一．实验器具：

1.移液枪：

1ml、200μl、20μl、

10μl、2.5μ

2.吸头：

1ml、200μl、20μl

3.匀浆管：

5ml

4.EP管：

1.5ml、500μl、200μl

5.试剂瓶：

棕色试剂瓶（广口，放

75%乙醇）

6.量筒：

100ml

7.容量瓶：

1000ml

8.试管架：

5ml、1.5ml、20μ

9.铝制饭盒：

1-2个

10.大瓷缸：

1个

11.锡泊纸：

一卷

12.卷纸：

2卷

13.三角烧瓶：

带盖，稍大

二．实验器具处理

1.塑料制品：

（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中（注意：

小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水），过夜后取出（注

意：

DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩

干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干）。

高压后烤干备用。

如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。

2.玻璃制品：

泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。

3.匀浆器：

（包括剪刀、镊子）先洗净后，超声消毒即可（不需要泡DEPC。

）

三．试剂配制

1．DEPC水：

吸出1mlDEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。

2．75%乙醇：

用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（DEPC水需先高压，高压时注意：

1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多

加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出）。

3．异丙醇：

放入棕色瓶中。

4．氯仿：

放入棕色瓶中。

5．琼脂糖

四．缓冲液配制

1．电泳缓冲液（5×TBE贮存液）：

Tris54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA20mlpH8.0、加蒸溜水至1000ml。

使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用（工作浓度）

2．上样缓冲液（6×缓冲液，4℃保存）：

0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制

1．1.0%：

1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾（如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志），熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min（可以放入4度冰箱加快琼

脂糖凝固）后现进行电泳。

2．1.5%:

同上，将琼脂糖的量改为1.5g

六．需购置材料

Taq酶（-20度保存）（配10×buffer和MgCl2）：

不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。

个人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。

dNTP（4度保存）：

向生物公司购买，原装和分装均可。

oligo（dT）15（-20度保存）：

可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货，每支10元，稀释后使用（注意稀释浓度），也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用，稀释液4度保存。

M-MLV（-20度保存）：

向生物公司购买，推荐使用Promega的，当然有钱可以购买更好的AMV。

RNasin（-20度保存）：

向生物公司购买，推荐使用Promega的，原装分装均可。

DEPC（4度保存）：

向生物公司购买，5克足矣。

Trizol（4度保存）：

有50ml和100ml规格，按照实验需要自己购买。

国外进口的有Invitrogen（Trizol）、罗氏（TriPure）、MRC（TriReagent）；国内的也行，天为时代的就不错。

Marker（物美价廉，上样

Marker（4度保存）：

按照目的条带大小购买，推荐使用天为时代的

电泳LoadingBuffer（4度保存）：

按照配方自己配制，不需要购买（购买的话价格挺贵）。

七．引物合成

1．内参照：

GAPDH（452bp）正义：

5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3

反义：

5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3

2．退火温度计算：

2（A+T）+4（G+C），正反义平均数，再上下波动4-5度。

3．引物2OD已足够，每管1OD分装。

4．引物稀释：

加DEPC水量（μl）＝Xnmol/OD（合成的引物管上有标注）×管上所标OD数（推荐每管引物为1OD分装，合成之前向公司说明这一点，切记！

！

）×100。

最终引物浓度为10pmol/μl。

八．PCR产物电泳

取1-10μl（一般取5μl）PCR产物，加已点在纸上的6×上样缓冲液，反复吸打混匀后进行电泳，一般用稳压状态进行电泳，100V左右，电泳20-30分钟，紫外灯下观察，结果进行扫描保存。

九．注意点：

1逆转录后应立即冰水浴2RNA抽提前，打开离心机预冷

TRIzol法抽提总RNA

组织100mg/细胞1×107

↓

加1mlTRIzol

↓

组织：

匀浆（彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管）

细胞：

用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

4℃，离心12000g，15分钟

↓

转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中

↓

加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟

↓

4℃，离心12000g，10分钟

↓

弃上清

↓

加冰预冷的75%乙醇（DEPC水配）1ml

↓

4℃离心7500g，5分钟

↓

弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）

↓

溶于DEPC水中

注意：

1.RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解。

2.细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）。

3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。

4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。

5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：

先按4的步骤吸干酒精，

其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头（DEPC处理过的）吸出多余的酒精。

最后用200μl中枪头（DEPC处理过的）吸11.5μl（20μl体系，如果是40μl体系则加倍）的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管（这些EP管中可以事先加好Oligo（dT）15，以节省枪头）中。

两步法RT-PCR

（第一步：

逆转录反应：

20μl体系，如果是40μl体系则加倍）

试剂浓度体积终浓度

RNA

11.5μl

Oligo（dT）150.05μg/μl

2μl0.005μg/μl

10倍的浓度）

（0.05μg/μlOligo（dT）15为Oligo（dT）15原液稀释

↓

混匀，离心，70℃5min

↓

总体积20μl

↓

混匀，离心，42℃60min

↓

95℃10min（破坏M-MLV）

↓

4℃保存

（第二步：

PCR反应：

总体积20μl，如果50μl体系，相应加倍）

试剂

浓度

体积

终浓度

TaqBuffer

10×

1×

MgCl2

25mM

1.5mM

dNTP

10mM

0.2μl

上游引物

10pmol/μl

0.4μl

下游引物

10pmol/μl

0.4μl

cDNA模板

1μl

DEPC水

14.7μl

Taq酶

2.5U/μl

0.1μl

↓

混匀

↓

95℃

5分

预变性

94℃

30秒

变性

X℃

30-40秒

退火

72℃

30秒

延伸

72℃

7分

终末延伸

2μl

1.2μl

（28-36循环，4℃保存）

注意：

1.Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。

2.dNTP保存在4度即可，勿反复冻融。

3.如果一次做很多管，可以先将共同需要的部分一起加（稍微多算一点，例如20管分装，可

以加入21-22管的量，因为枪头会吸附一定的液体，可能有人认为这样会浪费试剂，其实不然，因为每管分开加的话试剂用量更多，枪头吸附的试剂的量其实也是很可观的，特别是国产的枪头，这样做同时还能降低加样误差），然后各管分装，再加各自不同的部分。

4.如果200μl的EP管在PCR过程中盖子容易炸开，解决方法有：

（1）用封口膜将管口密封、

（2）最后每管加入液体石蜡进行液封。

是反转录的步骤如下：

1．电泳定量RNA或直接测定RNA浓度。

2．反转录体系:

（20μl）

RNA+DEPC水:

11μl,RNA量1-5μg

（引物）OligodT:

1μl

5XRTaseBuffer:

4μl（10XRTaseBuffer2μl+2μlDEPC水）

dNTP:

2μl

RTase:

1μl

Total:

20μl

42℃放置60min，70℃放置5min终止反应。

3．稀释母液模板，进行PCR反应。

Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

Western可以参考如下步骤进行操作。

1.收集蛋白样品（Proteinsamplepreparation）

可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液（P0013）、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0028）。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S）。

2.电泳（Electrophoresis）

（1）SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（P0012A）。

该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

（2）样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相

同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关

文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（P0015）。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

（3）上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准（P0066）。

电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液（P0014A/P0014B）。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。

对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。

SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪（带定时）（EEP102）。

为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE

过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。

设置定时

可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3.转膜（Transfer）

我们推荐在Western实验中选用PVDF膜（FFP36/FFP39）。

硝酸纤维素膜（NC膜）（FFN06/FFN09）也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。

膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转

膜时间为30-60分钟。

也可以在15-20mA转膜过夜。

转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪（带定时）（EEP102）。

具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。

转膜的效果也可以用丽春红染色液（P0022）对膜进行染色，以观察实际

的转膜效果。

也可以用考马斯亮蓝快速染色液（P0017）对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，

以观察蛋白的残留情况。

4.封闭（Blocking）

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液（P0023C）中，漂

洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。

从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

用微型台式真空泵（EVAC06/EVAC07）或滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液（P0023B），在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。

对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。

在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床（ESHK02或）类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

5.一抗孵育（Primaryantibodyincubation）

参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液（P0023A）稀释一抗。

用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。

或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。

回收一抗。

加入Western洗涤液（P0023C），在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。

吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。

共洗涤3次。

如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

注：

Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体（AT819）或Actin抗体（AA128），进行内参检测。

6.二抗孵育（Secondaryantibodyinucubation）

参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液（P0023D）稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。

二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二

抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）。

碧云天有多种二抗提供。

用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗。

加入Western洗涤液（P0023C），在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。

吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。

共洗涤3次。

如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7.蛋白检测（Detectionofproteins）

参考相关说明书，使用BeyoECLPlus（P0018等）ECL类试剂来检测蛋白。

压片可以采用专用的压片暗盒（FFC58/FFC83）进行。

洗片时可以使用X光片自动洗片机。

如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂

盒（P0019/P0020）自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

X光片推荐选用柯达原装的生物实

验专用柯达X-OMATBT胶片（FF057/FF081）。

8.膜的重复利用（Membranerecovery）

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液（P0025）处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。