皂化价的测定.docx

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皂化价的测定

实验目的

学习滴定分析法的基本原理及方法

掌握滴定分析的计算方法

实验原理

皂化价测定原理：

脂肪的碱水解称皂化作用。

皂化1g脂肪所需KOH的mg数，称为皂化价。

脂肪的皂化价与其Mr成反比（亦与其所含脂酸的Mr.成反比），由皂化价的数值可知混合脂肪（或脂酸）的平均Mr。

三酰甘油在碱溶液中水解，产物之一是脂肪酸的盐类（钠、钾盐），俗称皂。

脂肪酸的平均分子量Mr=3*56*1000/皂化值。

皂化值是三酰甘油中脂肪酸平均链长，即三酰甘油平均相对分子量的量度。

实验试剂

（1）0.100mol/L氢氧化钠乙醇溶液：

配好后以0.100mol/L盐酸标准液标定。

（2）0.100mol/L标准盐酸溶液：

取浓盐酸（比重0.19，A.R.）8.5mL，加蒸馏水稀释至1000mL，此溶液约0.1mol/L，需标定。

（3）70%乙醇（C.P.）：

取95%乙醇70mL，加蒸馏水稀释至95mL。

（4）1%酚酞指示剂：

称取酚酞1g，溶于100mL95%乙醇。

实验步骤

1.在分析天平上称取脂肪0.4299g，置于250mL烧瓶中，加入0.1mol/LNaOH乙醇液50mL。

2.烧瓶上装冷凝管于沸水浴内回馏45分钟，至瓶内的脂肪完全皂化为止（此时瓶内液体澄清并无油珠出现，若乙醇被蒸发，可酌情补充适量70%乙醇）。

3.皂化完毕，冷至室温，加1%酚酞指示剂2滴，以0.1mol/LHCl液滴定剩余的碱（HCl用量少可用微量滴定管），记录盐酸用量。

4.另作一空白试验，除不加脂肪外，其余操作均同上，记录空白试验盐酸的用量。

皂化值的测定

皂化价=（a-b）*C*56/脂肪重量（g）

式中：

a=空白实验所消耗的HCl的mL数；

b=脂肪试验所消耗的HCl的mL数；

C=HCl的浓度。

数据记录及其讨论

脂肪质量（g）

实验组消耗HCL量（ml）

空白组消耗HCL量（ml）

a0.4299

b51.9

57.0

皂化值的计算

皂化值=（a-b）*c*56/m

=（57.0-51.9）*0.1*56ml/0.4299g

=66.4ml/g=0.2656g/g表示消耗1g脂肪需要NaoH0.4299g.

结果讨论；标准植为0.1g/g左右，其意义是皂化一克脂肪需要消耗KOH

0.4299克，与实际相比可能是实验过程的干扰因素太多造成的。

酸价的测定

实验原理

酸价是指中和1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的mg数。

酸价表示脂肪酸败的程度。

油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。

反应式为：

RCOOH+KOH━RCOOK+H2O

酸败：

脂肪酸中不饱和成分自动氧化，产生过氧化物，进而间接成挥发性的醛酮酸的复杂混合物。

实验试剂

中性醇醚混合液：

取95%乙醇（C.P.）和乙醚（C.P.）按1∶1等体积混合；或苯醇混合液：

取苯（C.P.）和95%乙醇（C.P.）等体积混合；上述混合液加入酚酞指示剂数滴，用0.1mol/LKOH溶液中和至红色。

1%酚酞指示剂：

用70%—90%乙醇配制。

0.1mol/LKOH标准溶液。

实验步骤

（1）准确称取油指2.2867g于100mL三角烧瓶中，另取一个三角烧瓶不加油脂作空白。

（2）在两个瓶中加入混合溶液50mL，振摇溶解（固体脂肪需水浴溶化再加入混合溶液）或40℃水浴中溶化透明。

（3）加入酚酞指示剂1—2滴，用0.1mol/LKOH标准液滴定（KOH浓度视脂肪酸败程度而定）至淡红色1分钟不褪色为终点。

记录0.1mol/LKOH用量。

（4）计算：

酸价=C（V2-V1）*56.1/W

C：

标准KOH浓度/（mol/L）；

V2：

样品消耗KOHmL数；

V1：

空白所用KOHmL数；

56.1∶1mol/LKOH1mL所含KOHmg数；

W：

样品重量/g

数据记录及处理

C（mol/ml）

V1（ml）

V2（ml）

W（g）

0.1

0.40

0.65

2.2867

酸价的计算

酸价=C（V2-V1）*56.1/W

=0.1mol/ml*（0.65ml-0.40ml）*56.1/2.2867g

=0.61g/g

讨论1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的mg数为0.61

2，6-二氯酚靛酚法测定Vc的含量

碘量法测定Vc含量

试验目的

了解2，6-二氯酚靛酚法测定维C含量的方法步骤比较两种方法的优缺点

（一）2，6-二氯酚靛酚法测定维C含量

实验原理

Vc具有还原性，可以还原2，6-二氯酚靛酚（由玫瑰色至无色），所以可以用2，6-二氯酚靛酚滴定样品溶液中的Vc

实验试剂

菜花%10HCL溶液偏磷酸—醋酸溶液2，6-二氯酚靛酚溶液=

实验步骤

1、30g菜花在研钵中研磨后，用滤纸过滤，滤液置50毫升容量瓶中，用偏磷酸溶液定容，至50毫升，备用。

2、量取10毫升滤液，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至玫瑰色5s不退色为滴定终点（滴定过程不超过2分钟），记录2，6-二氯酚靛酚溶液用量。

3、空白取偏磷酸溶液10ml，滴定

注意事项

提取时，滤液过度浑浊会影响滴定终点的判断，纱布过滤时，要尽可能滤干净抽提液，以免有残留的Vc。

终点时玫瑰色要持续15s.

滴定速度要尽可能快一点，以免杂质干扰反应。

数据记录集其处理

样品质量

（g）

试剂

开始体积（VA）

（ml）

终止体积（VB）

（ml）

消耗体积（VA-VB）（ml）

2，6-二氯酚靛酚

18.70

20.90

2.200

30.30

空白组用试剂

21.10

21.30

0.200

结果计算

Vc=（Vb-Va）/w*s*100

W=30.30*10/50=6.06

s=0171mg/ml

Vc=（2.200-0.200）*0.171/6.06*100

=5.64mg/100g,

100g菜花中含有维生C5.640mg

注意事项

1：

生物组织提取液中维生素C还能以脱氢和结合的形式存在，这两种形式的维生素C都具有还原性的生物活性，却不能将2，6二氯酚还原脱色。

2：

生物组织提取液中常会有天然色素，干扰对滴定终点的观察。

3：

为了增加反映的特异性，最简单的方法是加快滴定速度，因为很多干扰物质与2，6二氯酚的反应比较缓慢。

（二）碘量法测定

实验原理

2CuSO4+4KI-------2CuI2+2K2SO4

2CuI2---------Cu2I2+I2

上述反应中产生的碘可以迅速氧化维生素生成脱氢抗坏血酸与碘化氢，过量的碘可以与淀粉反应生成蓝色

实验试剂

上述实验菜花定容液0.01mol/l硫酸铜1%可溶性淀粉指示剂溶液偏磷酸—醋酸溶液

实验步骤

取上述定溶液10ml,用0.01mol/l硫酸铜溶液滴定

空白实验,10ml偏磷酸—醋酸溶液用0.01mol/l硫酸铜滴定

数据记录及其处理

菜花质量为30.30g

硫酸铜试剂

实验组

对照组

滴定前体积V1（ml）

9.350

21.10

滴定后体积V2（ml）

14.62

26.32

消耗体积V（ml）

5.270

5.220

结果计算

Vc=5.270*0.050*0.88/6.06*100mg/100ml

=4.40mg/100ml

思考题

1，碘量发测定中所用KI浓度为何高达30%

答：

因为2CuSO4+4KI-------2CuI2+2K2SO4

2CuI2---------Cu2I2+I2

反应产生的碘可以迅速维生素C生成脱氧抗坏血酸和碘化氢，过量的碘与淀粉的反应生成蓝色，所以当KI浓度高达30%时使含量较低的VC反应灵敏，由实验结果可知VC含量为4.40mg/100g，因此当反应KI浓度高时可以充分快速与微量的VC反应，产生的碘易挥发，利于实验结果的测定。

2，根据实验结果判断两种实验方法的精确度哪个高？

原因如何

答：

方法一测定的结果为5.64mg/100g,,而碘量法为4.40mg/100mg,5.64mg/100g>4.40mg/100g

所以2，6-二氯酚靛酚法测定维C含量的方法更好.

蒽酮比色定糖法

实验目的

学习分光光度法的基本原理

学习对蔬菜和食品中糖含量进行测定的方法

实验原理

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。

蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。

蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。

当样品中存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。

对于以上特定的糖类，反应较稳定。

本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。

实验试剂

蒽酮试剂：

取0.2g蒽酮溶于100mL80%（V/V）硫酸中，当日配制使用；

标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）：

（可滴加几滴甲苯作防腐剂）；

糖样品溶液。

实验步骤

1.制作标准曲线：

取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0.1，0.2，0.3mL,0.4ml，0.5ml,并依次用蒸馏水补足体积到1mL，各管均加入蒽酮试剂4mL，混匀后沸水浴准确煮沸10min，自来水冷却，室温放置10min，比色测定A620。

2.样品含糖量测定：

吸取1mL无蛋白糖溶液置试管中，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。

计算：

糖含量（mg/ml）＝A*C/W

样品稀释后的体积

C：

标准曲线查出的糖含量。

W：

样品的体积

数据记录及其处理

数据记录

标准葡萄糖夜（）

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

吸光度值

0.06

0.132

0.243

0.293

0.359

测得糖液的吸光度值为0.1时0.015mg/ml所以糖含量为*10/0.06=2.5mg/100ml

所以糖含量为5*2.5/100/10*100%=12.5%

蛋黄总胆固醇的测定（邻苯二甲醛法）

实验目的

学习分光光度计的原理及操作

学习用分光光度法测定蛋黄中总胆固醇（脂肪）含量及标准曲线的制作

实验原理

根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，称为分光光度法（spectrophotometry）。

该法具有一定的灵敏度和准确度，分析手续较简便快速，仪器设备也不复杂，故应用很广。

吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。

吸光系数的大小，取决于物质（溶质、溶剂）的本性和光的波长。

1.物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的特性常数。

在分光光度法中，常用摩尔吸光系数ε来衡量显色反应的灵敏度，ε值越大，灵敏度越高。

2.溶剂不同，其吸光系数亦不同，

3.光的波长不同，其吸光系数亦不同。

如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度—波长曲线，称为吸收曲线（absorptioncurve），吸收曲线上有极大值的部分，称为吸收峰。

吸收峰所对应的波长，称为最大吸收波长，以符号λmax表示，这是物质定性的依据之一。

4.单色光的纯度也影响吸光系数。

单色光越纯，即经单色器分光后的波长范围越窄，其吸光系数越大

•定量方法：

1.吸光系数法

2.标准曲线法

不是任何情况下都能适用的。

特别是在单色光不纯的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不同而在一个相当大的幅度内变化不定，若用吸光系数换算成浓度，则将产生很大误差。

先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相同情况下，分别测定其吸光度，然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A—C关系图，在相同条件下测出样品溶液的吸光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓度。

3.对照法

实验试剂

邻苯二甲醛试剂醋酸（90%）混合酸标准胆固醇应用夜

实验步骤

标准曲线的绘制

向5支试管中依次加入标准胆固醇应用夜0，0.1，0.2，0.3，0.4ml，再依次加入醋酸（90%）

使各管体积均为0。

4ml，然后，各管加邻苯二甲醛试剂0.2ml,蒸馏水0.01ml,混合酸4ml,混匀,静置10分,测550nm吸光度值,然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐绘制A—C关系图

样品测定

取两支试管加入醋酸0.4ml,蛋黄0.01ml,再加入以下试剂

对照

样品

邻苯二甲醛试剂/ml

0．2

无水乙醇/ml

0．2

混合酸/ml

4．0

加毕，混匀，静置10分，以对照管较零测550纳米下的吸光度值，计算胆固醇的含量

数据记录

标准胆固醇浓度

0.01

0.02

0.03

0.04

吸光度值

0.178

0.367

0.584

0.796

标准曲线

样品吸光度值为0.475，由图可知样品胆固醇量为0.475/0.023mg/100ml=20.65mg/100ml

由于标准样品中胆固醇的含量为600mg/ml因此胆固醇的含量为20.65mg/ml/600mg/ml*100%=3.44%

考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量

试验目的

学习分光光度计的原理及操作

学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度

实验原理

利用某些物质的分子吸收紫外光、可见光、红外光和激光200-800nm光谱区的辐射来进行定性定量分析和物质结构分析测定的方法。

称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。

这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。

考马斯亮蓝染色法测定

原理：

考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg/mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。

操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。

去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定

试剂:

标准蛋白质溶液（0.5mg/ml）

考马斯亮蓝G250蛋白染色剂

实验试剂

1.标准蛋白质溶液：

0.5mg/ml牛血清白

2.考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：

实验步骤

1标准曲线的绘制

1）取7支试管，分别加入0，0.4，0.6，0.8，1.01.2，1.4ml标准蛋白质溶液，用水补足至3ml

向每个试管中加入5加入ML;的考马斯亮蓝试剂充分震荡混合2分后于595纳米测吸光度至

，以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线作为定量的依据

2，样品测量

取样品溶液1ML加水1ML,然后加5ml考马斯亮蓝试剂用标准曲线测样品蛋白质含量

数据记录及处理

试管

样品

浓度

0.067

0.100

0.133

0.167

0.200

0.233

0.171

光吸收值

0.684

0.770

0.792

0.896

0.904

0.887

0.860

标准曲线

有标准曲线可知当被侧样品的吸光度值为0.860时其浓度大约为0.160所以原样品的浓度为0.160mg/ml*3ml/1ml=0.480mg/ml,原样品的蛋白质含量为0.480mg/ml/0.50mg/ml*100%=96%

紫外吸收法测定蛋白质的含量

实验目的

学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法

实验原理

大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。

但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，warburg——等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。

该方法是以酵母烯酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差。

实验步骤

1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于751型分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280和A260，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。

2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。

蛋白质含量（mg/ml）=1.45A280—0.74A260

数据记录及其处理

260纳米光吸收值

次数

平均

样品

1.723

1.733

1.740

1.732

空白

0.000

280纳米处光吸收值

次数

平均

样品

2.221

2.312

2.172

2.235

空白

0.000

计算

蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280—0.74A260

=1.45*2.235-0.74*1.732

=1.959mg/ml

血清转氨酶的活性测定

实验目的

了解血清转氨酶的活性测定方法

实验原理

体内最常见的转氨酶有两种，谷草转氨酶（谷氨酸－草酰乙酸氨基移换酶（AST，GOT）、谷丙转氨酶（也称作丙氨酸氨基移换酶，（ALT，GPT）身体内的转氨酶不止一种。

目前临床诊断中常用的有谷丙转氨酶及谷草转氨酶等。

体内尤以骨骼肌、肝、心、脑、肾、胰、脾等转氨酶活力最强。

此外，性腺、肺、消化道、红细胞、血小板、血清等，也含有不同活力的转氨酶。

不同的组织所含的各种转氨酶的多寡也不一致，比如谷丙转氨酶按其含量多寡为：

肝、肾、心肌、脑；而谷草转氨酶之次序为：

心肌、脑、肝、肾。

当含有转氨酶的组织细胞发生破坏或损害时，相应的转氨酶则可进入血流引起血清内酶活力的增高，可以作为判断某一器官疾病的指标。

急性传染性肝炎、血清性肝炎、慢性肝炎活动期、肝硬变代偿期、阻塞性黄疸、心肌梗死；急性胰腺炎、胆囊炎、风湿活动性心脏病及一些对肝脏有毒害的药物如安眠药、麻醉药、锑剂、砷剂等均可使转氨酶活性升高。

转氨酶升高原因肝细胞受损伤，使细胞内酶泄露，进入血液，从而引起酶活性升高。

（转氨酶水平在0—40之间是正常的

转氨酶活力的测定ALT作用于丙氨酸及α－酮戊二酸基质，反应生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可以与2，4－二硝基苯肼定量反应生成丙酮酸苯腙，在碱性条件下呈红色，可以用分光光度法定量检测（500nm）。

实验仪器，试剂

仪器723型分光光度计

试剂磷酸盐缓冲液（PH7.4），ALT底物液（含丙氨酸（过量），α－酮戊二酸）、2，4－二硝基苯肼溶液，0.4MNaOH溶液，丙酮酸标准液。

实验步骤

1、绘制标准曲线

取4支试管，如下表加入试剂，绘制标准曲线

试剂对照1234

500nm吸光度值0.1690.2000.2280.2600.280

加入上述试剂后，37℃水浴5min,各管在加入2，4－二硝基苯肼

溶液0.5mL，混匀，水浴20min，再加入0.4MNaOH溶液5mL，混匀，

于500nm处测量光吸收值。

2，血清ALT的测定

试剂测定管对照管

血清0.10.1

ALT底物0.50

37℃水浴30min（酶促反应）

2，4－二硝基苯肼0.50.5

ALT底物00.5

吸光度值0.2840.241

水浴20分钟后加入再加入0.4MNaOH溶液5mL，混匀，于500nm处测量光吸收值。

根据标准曲线查出样品的ALT活力单位

结果计算及其分析

标准曲线

由曲线可知当吸光度值为0.284时，为32ALT单位

思考题

血清ALT活力测定时，对照管也加入了相应体积的血清，为什么这样做？

答;试验对照组的设立以单一变量为原则，同时加入血清使试验更合理，人血清中ALT活力测定是以37度加热是否存在ALT底物为变量的，37度家人符合人的体温，测定有实际意义。

（一）氨基酸纸层析

实验目的

氨基酸纸层析：

掌握分配层析的原理

根据氨基酸的不同性质分离氨基酸

实验原理

氨基酸纸层析

分配层析：

利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。

固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。

纸层析：

纸层析法是用滤纸作支持剂，以纸上所吸附的水作固定相，用与水不相混溶或相混溶的溶剂作展开剂，是流动相。

当流动相沿纸条移动时，带动着试样中的各组分以不同的速率向前移动，在一定时间内，不同组分被带到纸上的不同部位，出现层析现象，以达到分离的目的。

溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：

Rf＝溶质斑点中心的移动距离/溶剂前沿移动的距离

实验试剂

1、展开剂：

正丁醇：

88%甲酸：

水=15：

3：

2、茚三酮显色液

3、０．５％标准氨基酸溶液：

赖氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、

４、样品氨基酸溶液：

混合氨基酸

实验步骤

１、环形层析滤纸的制备：

圆形滤纸圆心处剪一个小孔（尽量圆），距圆孔边1cm左右用铅笔画一圈环线，标注４个点样点（原点）。

２、点样：

用毛细管分别吸取不同氨基酸样品，样品点于原点上。

点一次后，晾干后再点一次，一共点３－４次。

（注意：

每次点在相同位置）

３、滤纸条制作：

用粗滤纸卷成适合圆孔大小的滤纸条，使滤纸条和环形滤纸充分接触。

实验步骤

４、展开：

培养皿中倒入展开剂，滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动。

展开结束后，在展开剂边缘用铅笔作好记号。

５、显色：

展开结束后，吹干滤纸。

用毛笔蘸茚三酮显色液由圆心向外涂刷，６５度烘干显色。

五、实验结果

定性：

测量Ｒｆ值，用样品溶液的层析图谱同标准氨基酸比较，根据Ｒｆ值的大小，确定样品中氨基酸种类。

实验结果计算：

溶剂前沿到原点距离Ｌ＝7.1cm

数据记录

Rf（丙氨酸）=1.６/７.１=0.2254

Rf（谷氨酸）=1.５/７.１=0.2113

Rf（赖氨酸）=０.３/７.１=0.0423

Rf（苯丙氨酸）=２.９/７.１=0.4085

Rf（亮氨酸）＝３.５/７.１＝０.4930　

Rf（测）＝１.５/７.１＝０.2113

Rf（测）＝３.２/７.１＝０.4507

结果讨论

这次试验相对来说还是比较成功的氨基酸的迁移率和它自生的性质有关，在展开剂中的溶解度越大迁移率越大．

说明赖氨酸的性质最稳定

（二）蛋清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

试验目的

了解生物大分子的电泳分离原理

了解电泳的基本操作方法

实验原理

电泳和电泳技术：

混悬于溶液中的带电质点在外加电场作用下，向着与之带相异电荷的电极方向移动的现象叫做“电泳”。

利用电泳现象来达到将多组分物质分离分析或分离制备的技术叫做电泳技术。

醋酸纤维素薄膜电泳：

蛋白电泳支持介质的种类较多，如滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂糖等。

蛋白质和氨基酸都是两性电解质，其分子中的羧基（—COOH）和氨基（

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