饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法.docx
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饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法
《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》
河南省地方标准编制说明
一、编制的目的和意义
氨基酸是羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有基和氨羧基两种官能团。
与羟基酸类似，其可按照氨基连在碳链上的不同位置而分为α-，β-，γ-...w-氨基酸，但经蛋白质水解后得到的氨基酸都是α-氨基，它们是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是维持动物生长所必需的营养物质，其种类和含量是评价饲料蛋白质营养价值的根本指标，测定饲料中的氨基酸具有非常重要的意义。
随着畜牧养殖业的迅猛发展，对饲料营养成分分析也提出了更高的要求。
饲料分析已从比较单一的高含量营养成分，如蛋白质、脂肪等的总量分析，深入到比较复杂的微量营养素，如多种氨基酸、维生素、微量元素及饲料中的有害物质等分析。
目前，饲料产品国标中氨基酸的测定采用的是离子交换柱后茚三酮衍生色谱法。
但众所周知，该方法使用的氨基酸自动分析仪价格昂贵（约70万左右），专属性强，只能分析氨基酸，且分析速度慢。
而采用高效液相色谱法测定氨基酸，具有价格便宜，分析速度快、灵敏度高、操作简便的特点，其次，目前很多实验室都配置了高效液相色谱仪，其价格易于接受（约10万左右），而且它的分析范围很广，可测定饲料中的氨基酸、维生素、碳水化合物、脂肪酸、有机酸、添加剂（风味剂、防腐剂等）和有害物质（如黄曲霉素、棉酚和农药残留等），因而实现了一机多用的可能。
相比于目前国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》规定的氨基酸分析方法，高效液相则具有较好的通用性，应用范围广且市场占有率高，利于推广。
随着高效液相色谱技术的日趋成熟和普及，高效液相色谱法必将成为各检测机构测定氨基酸含量的主要方法。
2、任务来源及编制原则和依据
2.1任务来源
根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第四批河南省地方标准制修订计划的通知》豫质监标发〔2017〕355号的要求，由河南海瑞正检测技术有限公司负责对项目编号为20174210667的河南省地方标准《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》的起草、制定工作。
2.2编制原则
本标准编制符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循“规范性、实用性、统一性、协调性、完整性”的原则，开展了本次研究工作，填补检测方法单一的空白，并注重标准的可操作性。
2.3编制依据
本标准在编制过程中参照的主要标准及依据如下：
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB10648饲料标签
GB/T14699.1饲料采样
GB/T18246-2000饲料中氨基酸的测定
GB19489实验室生物安全通用要求
3、编制过程
2017年11月9日,收到河南省质量技术监督局下达的标准制修订通知，本标准被列入2017年第四批河南省地方标准制修订计划。
收到制定计划后，作为项目主持单位，河南海瑞正检测技术有限公司成立了标准起草小组。
小组成员经充分讨论和酝酿，制订了实施方案，就起草工作进行调研、汇总、分析、试验验证、制定标准框架、起草标准进度等内容，进行了明确的分工。
2017年12月标准起草小组相关人员就着手收集了饲料中氨基酸的测定的标准、书籍资料等，并分门别类整理出了有关方面的研究论文、技术文献资料。
根据标准制定相关要求，考虑与现行国家标准的一致性原则，重点研究国内外有关饲料中氨基酸检测的标准体系。
2018年1月～3月，标准编写小组编写制定整理出了标准编写所需的资料，为起草标准作出了多方面的准备。
与此同时，实验室相关人员按计划进行了大量试验验证工作。
2018年4月，标准编写小组对有关文献资料进行了梳理总结，同时召开了标准起草小组会议，对编写提纲进行了讨论，标准编制严格按照《标准化工作导则》（GB/T1.1）关于标准的结构和编写规定等要求进行，初步确定了标准框架。
根据试验资料和所有参与试验人员意见，在科学分析的基础上，组织有关专家规定了适用范围、规范性引用文件、方法原理、设备材料、测定步骤、结果的表述、试验结果的判定等，起草了标准草案。
2018年5月，标准起草单位将标准草案送至饲料中氨基酸检测的有关专家学者征求意见，编制出了《河南省地方标准征求意见汇总表》。
2018年6月，标准起草小组根据征求专家学者反馈的指导意见，对标准草案的每一组数据、每一句表述进行了认真而全面的补充、调整和完善，并经多次小组讨论最终形成《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》征求意见稿并完成上报工作。
主要起草人及其任务分工：
项目主持人：
兰尊海，河南海瑞正检测技术有限公司，主持本项地方标准的制定与编写。
主要起草人：
兰尊海：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和技术推广。
单慧燕：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和应用。
易善平：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制校订和应用。
薛宁：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定。
许亚楠：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的校订和应用。
李培娜：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责此标准方法的应用。
孙世雯：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准校订和应用。
4、主要内容的确定
（一）与国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》的对比：
1.出峰时间进行比较
根据标准要求，用高效液相色谱法和国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》，对氨基酸样品进行分析，出峰时间如图1、图2所示，氨基酸分析仪出峰完全在110min左右，而高效液相色谱法的出峰时间在36min左右，大大节省了检测时间，提高了工作效率。
图1氨基酸自动分析仪-氨基酸色谱图
图2高效液相色谱法-17种氨基酸色谱图
2.结果准确性进行比较
选用浓缩料和脱脂鱼粉两类饲料样品，分别进行本方法和国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》，两种方法进行比对，结果从表1可以看出，两组数据的相对偏差分别为0.50%、0.28%，远远小于标准要求4.0%的相对偏差，说明高效液相测定氨基酸结果准确可靠，方法可行。
表1两种方法氨基酸的测定结果
组分名称
本标准GB/T18246本标准GB/T18246
浓缩料
脱脂鱼粉
天门冬氨酸（asp）
3.28
3.19
6.30
6.22
谷氨酸（glu）
5.49
5.46
9.70
9.84
丝氨酸（ser）
1.37
1.36
2.68
2.84
精氨酸（arg）
2.23
2.20
4.20
4.30
甘氨酸（gly）
1.24
1.20
4.55
4.52
苏氨酸（thr）
1.08
1.07
2.99
3.01
脯氨酸（pro）
1.37
1.34
3.02
2.90
丙氨酸（ala）
1.25
1.20
4.45
4.37
缬氨酸（val）
1.35
1.35
3.60
3.45
蛋氨酸（met）
0.57
0.56
2.15
2.09
胱氨酸（cys）
0.26
0.26
0.53
0.50
异亮氨酸（ile）
1.25
1.31
3.14
3.06
亮氨酸（leu）
2.19
2.16
5.53
5.34
苯丙氨酸（phe）
1.45
1.44
2.92
2.87
组氨酸（his）
0.87
0.87
1.85
1.87
赖氨酸（lys）
1.86
1.86
5.80
5.82
酪氨酸（tyr）
0.89
0.88
2.24
2.30
氨基酸总和
27.99
27.71
65.67
65.30
相对偏差（%）
0.50
0.28
（二）高效液相色谱法实验条件的优化：
1.样品前处理优化条件
酸解剂用量的优化：
分别取酸解剂5mL、10mL、15mL，由表2实验结果表明酸解剂为5mL时，结果较低，说明水解不完全，在酸解剂用量为10mL和15mL时，结果一致，说明水解完全，本着节约的原则，为减少浪费，10mL为最佳酸解剂的用量。
表2不同酸解剂用量测定结果
组分名称
酸解剂（mL）
5
10
15
天门冬氨酸（asp）
5.96
6.28
6.28
谷氨酸（glu）
8.98
9.63
9.57
丝氨酸（ser）
2.09
2.32
2.38
精氨酸（arg）
3.84
4.10
4.05
甘氨酸（gly）
4.34
4.62
4.63
苏氨酸（thr）
2.76
2.96
2.98
脯氨酸（pro）
2.89
3.10
3.09
丙氨酸（ala）
4.24
4.56
4.52
缬氨酸（val）
3.45
3.68
3.67
蛋氨酸（met）
2.02
2.22
2.22
胱氨酸（cys）
0.46
0.52
0.53
异亮氨酸（ile）
2.92
3.09
3.05
亮氨酸（leu）
5.08
5.45
5.44
苯丙氨酸（phe）
2.72
2.76
2.76
组氨酸（his）
1.63
1.74
1.68
赖氨酸（lys）
5.40
5.74
5.71
酪氨酸（tyr）
2.06
2.19
2.15
氨基酸总和
60.84
64.94
64.71
2.衍生温度的优化:
将衍生温度设置为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃五个梯度，其余参数同标准要求，结果如表3所示，衍生温度在50℃到60℃时，结果处于上升趋势，在60℃到65℃时，结果稳定，在70℃时，结果明显偏高，由此说明，温度低于60℃时，衍生不完全，结果偏低；温度高于65℃时，衍生试剂里的有机试剂易挥发，导致结果偏高。
综合考虑，衍生温度选定在60℃时较为合适。
表3不同衍生温度测定结果
组分名称
衍生温度（℃）
50
55
60
65
70
天门冬氨酸（asp）
5.50
5.99
6.29
6.27
6.63
谷氨酸（glu）
8.82
9.27
9.66
9.59
9.84
丝氨酸（ser）
2.23
2.29
2.32
2.26
2.30
精氨酸（arg）
3.85
4.04
4.09
4.08
4.16
甘氨酸（gly）
4.34
4.49
4.61
4.58
4.82
苏氨酸（thr）
2.83
2.96
2.98
2.95
3.15
脯氨酸（pro）
2.93
2.99
3.09
3.08
3.21
丙氨酸（ala）
4.25
4.39
4.55
4.53
4.73
缬氨酸（val）
3.45
3.53
3.66
3.64
3.76
蛋氨酸（met）
2.11
2.12
2.23
2.26
2.33
胱氨酸（cys）
0.48
0.50
0.54
0.54
0.55
异亮氨酸（ile）
2.92
2.96
3.09
3.08
3.23
亮氨酸（leu）
5.16
5.25
5.44
5.43
5.65
苯丙氨酸（phe）
2.51
2.73
2.75
2.75
2.88
组氨酸（his）
1.49
1.65
1.74
1.77
1.87
赖氨酸（lys）
5.37
5.56
5.75
5.73
5.92
酪氨酸（tyr）
1.98
1.98
2.18
2.17
2.27
氨基酸总和
60.19
62.69
64.97
64.69
67.30
3.衍生时间的优化
将衍生时间设置为：
20min、25min、30min、35min，结果如表4数据可以看出，衍生时间由20min到30min时，结果呈上升趋势，表明衍生时间低于30min时，衍生不完全，实验结果偏低；衍生时间为30min和35min时，结果相同，说明在30min时样品已经衍生完全，本着提高效率、节约资源的原则，确定30min为最佳衍生时间。
表4不同衍生时间实验结果
组分名称
衍生时间（min）
20
25
30
35
天门冬氨酸（asp）
5.62
6.02
6.29
6.30
谷氨酸（glu）
8.81
9.22
9.64
9.67
丝氨酸（ser）
2.10
2.32
2.37
2.35
精氨酸（arg）
3.79
3.92
4.12
4.15
甘氨酸（gly）
4.33
4.45
4.70
4.67
苏氨酸（thr）
2.77
2.93
2.98
3.02
脯氨酸（pro）
2.89
2.96
3.13
3.13
丙氨酸（ala）
4.21
4.33
4.56
4.57
缬氨酸（val）
3.43
3.52
3.68
3.62
蛋氨酸（met）
2.06
2.11
2.22
2.26
胱氨酸（cys）
0.51
0.54
0.56
0.53
异亮氨酸（ile）
2.89
2.95
3.14
3.11
亮氨酸（leu）
5.10
5.20
5.53
5.49
苯丙氨酸（phe）
2.55
2.64
2.77
2.77
组氨酸（his）
1.37
1.56
1.68
1.73
赖氨酸（lys）
5.37
5.49
5.78
5.73
酪氨酸（tyr）
2.03
2.08
2.22
2.22
氨基酸总和
59.81
62.23
65.38
65.31
4.方法精密度实验
取试样溶液一份，按照本标准要求的色谱条件重复进样6次，结果如表5所示,氨基酸各组分的相对标准偏差在0.63%～2.28%之间，实验结果表明：
该方法测定氨基酸有较好的重复性。
表5方法的重复性实验结果
组分名称
测定次数
RSD（%）
1
2
3
4
5
6
天门冬氨酸（asp）
6.47
6.43
6.31
6.37
6.25
6.38
1.26
谷氨酸（glu）
9.74
9.71
9.67
9.68
9.44
9.68
1.13
丝氨酸（ser）
2.23
2.25
2.23
2.26
2.23
2.28
0.95
精氨酸（arg）
4.24
4.15
4.25
4.18
4.14
4.24
1.15
甘氨酸（gly）
4.74
4.65
4.65
4.57
4.53
4.63
1.54
苏氨酸（thr）
2.93
2.94
2.93
2.86
2.95
2.92
1.02
脯氨酸（pro）
3.15
3.10
3.08
3.04
2.97
3.02
2.04
丙氨酸（ala）
4.63
4.55
4.52
4.47
4.37
4.45
1.99
缬氨酸（val）
3.82
3.68
3.68
3.64
3.56
3.68
2.28
蛋氨酸（met）
2.24
2.22
2.22
2.24
2.21
2.25
0.83
胱氨酸（cys）
0.56
0.55
0.54
0.55
0.54
0.56
1.41
异亮氨酸（ile）
3.22
3.22
3.23
3.19
3.19
3.24
0.63
亮氨酸（leu）
5.63
5.57
5.59
5.51
5.44
5.58
1.22
苯丙氨酸（phe）
2.96
2.98
2.99
2.94
2.88
2.98
1.44
组氨酸（his）
1.84
1.85
1.87
1.88
1.77
1.86
2.13
赖氨酸（lys）
2.90
2.88
5.84
5.78
5.73
5.84
1.09
酪氨酸（tyr）
2.07
2.02
2.06
2.01
2.01
2.03
1.18
氨基酸总和
66.34
65.73
65.65
65.16
65.63
65.45
1.10
5、与有关的法律、法规和强制性国家标准的关系
本标准为新制订的地方标准，在标准的制订过程中严格贯彻国家有关方针政策、法律法规，以符合国家相关规范性文件为前提，在法规许可范围内提出科学合理的检测要求，与现行的国家相关法律、法规无冲突和不一致之处，遵循了政策性和协调同一性的原则。
6、标准实施的建议
该项技术标准的制定，试验数据充分、科学性强，可作为河南省推荐性地方标准在饲料中氨基酸的测定工作中进一步推广应用。
由于本标准为首次制定，建议全省的检测机构和企业能深入理解和熟练运用该标准，同时加大标准宣贯力度，建议作为推荐性地方标准发布实施。
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