第8章细菌的遗传分析.docx

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第8章细菌的遗传分析

第8章细菌遗传分析

重点：

大肠杆菌的性别特性和重组

特征，细菌重组作图的方法

，细菌同源重组的机制。

难点：

细菌重组作图的方法。

第一节细菌的细胞和基因组

一、细菌的细胞

二、细菌的基因组

一、细菌的细胞

细菌:

真细菌（如大肠杆菌）

古细菌（如詹氏甲烷球菌）

多种形态存在：

球菌（cocci）

杆菌（bacilli）

螺旋菌（sprilla）等

大小随种类不同而异：

杆菌一般长1～5㎛，宽0.5～1㎛；

球菌以直径大小表示，一般为0.5～1㎛；

螺旋菌一般长为1～50㎛，直径为0.5～1㎛。

细菌结构

简单：

其基本结构，包括细胞壁、细胞膜、染色体、核糖体、细胞质及内含物。

特殊结构如荚膜和鞭毛。

细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没有纺锤体结构。

细菌繁殖：

双链环形DNA分子随着细胞伸长而采取二分分裂（binaryfission）的方式分开。

二、细菌的基因组

细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没有组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。

细菌染色体位于细胞内一个称为“拟核”（nucleoid）的区域中。

细菌的染色体长度为250～35000μm不等。

大肠杆菌基因组长4.7×106bp，在松弛状况：

1300μm长，是其细胞长度的1000倍，必须压缩最少1000倍后才能装入细胞中。

实验证明：

在DNA分子进行折叠和螺旋化过程中还依赖于RNA分子的作用。

除了含有一条染色体外，大部分细菌还含有小的环状的DNA分子（质粒）。

质粒的复制独立于细菌染色体。

第二节大肠杆菌的突变型

及其筛选

一、大肠杆菌的突变类型

二、细菌的培养与突变体筛选

一、大肠杆菌的突变类型

1、合成代谢功能的突变型

野生型品系在基本培养基上具有合成

所有代谢和生长所必需的复杂有机物的

功能，这称为合成代谢功能。

这需要大

量基因的表达，其中任何一个必需基因

突变都会阻碍整个合成代谢功能的实现

，这种突变型也称为营养缺陷型。

2、分解代谢功能的突变型

野生型品系能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子，如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。

这些降解功能称为分解代谢功能。

这也需要许多相关基因的表达，其中任何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。

这种突变型称为分解代谢功能的突变型。

3、抗性突变型

细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗生素产生抗性，对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。

细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。

抗链霉素突变型的核糖体30S亚基的S12蛋白不再和链霉素结合，因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。

二、细菌的培养与突变体筛选

细菌的培养方法

基本培养基：

仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，称为基本培养基。

完全培养基：

凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基，称为完全培养基。

一般可在基本培养基中加入富含氨基酸，维生素和碱基之类的天然物质

配制而成。

细菌的培养有两种方法：

液体培养基培养法和固体培养基表面培养法。

固体培养法有利于细菌的分离和计数。

固体培养基上每个单独的菌落就是一个细菌细胞的克隆。

第三节细菌的遗传分析

一、接合

二、F因子

三、中断杂交与重组作图

四、F’因子与性导

五、转化与作图

六、转导与作图

细菌中，大肠杆菌（E.coli）是最为广泛的遗传学实验材料。

细菌遗传物质的传递可以通过三种途径来来实现：

1）接合（conjugation）：

通过供体与受体之间的接触而传递DNA。

2）转化（transformation）：

是指游离的细菌DNA片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）。

3）转导（transduction）：

是指一种细菌的DNA片段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。

一、接合

经细菌细胞直接的接触，把一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而实现遗传重组。

1）细菌经典的杂交实验

细菌的重组最初是在E.coli中发现的。

1946年Lederberg&Tatum通过E.coliK12菌株杂交实验首次证明E.coli的有性生殖和基因重组。

不同营养缺陷型的大肠杆菌：

A菌株：

Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。

B菌株：

Met+bio+thr-leu-，需加苏氨酸和亮氨酸。

A菌株和B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。

A菌株和B菌株混合培养在完全培养基上，几小时后离心，涂布在基本培养基上，长出原养型（Met+bio+thr+leu+）菌落。

问题：

1）这种原养型细菌的出现可能是培养上的互补，即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收呢？

2）另一种可能是一个品系的DNA片段逸出细胞后，携带着相应的基因进入另一个品系的细胞，因为这种转化作用而产生了上述的营养型？

1950年Davis的U型管实验

他用一个U型管，在底部用一块细菌过滤器隔开。

U型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和B，使它们繁殖到饱和状态，同时在U型管的一端交替地吸和压，使两臂中的培养液充分混合，但细菌的两个品系的细胞却不会接触。

在U型管中培养一些时间后，再从两端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。

Lederberg和Tatum认为两个亲本细菌在基因重组过程中起着同等作用。

Hayes则证明：

E.coli遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂的生物不同。

例如：

两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等，有些亲本基因的组合会在后代出现，有一些则不会出现，而且所有后代中出现的基因都是连锁的。

1952年Hayes的细菌杂交实验

菌株A：

met-thr+leu+thi+

菌株B：

met+thr-leu-thi-

菌株A（经链霉素处理，不能分裂）与菌株B混合，涂布在基本培养基上，有活下来的菌落；

菌株B（经链霉素处理，不能分裂）与菌株A混合，涂布在基本培养基上，没有活下来的菌落。

结论：

Hayes认为E.coli遗传物质的传递不是交互进行的，而是一种单向转移的结果。

其中品系A作为遗传物质的供体，品系B的细胞则是遗传物质的受体。

当两个亲本细胞接触后，供体A的遗传物质进入受体B的细胞中，紧接着遗传重组现象就在受体品系B的细胞中发生。

供体品系相当于雄性，受体品系则相当于雌性

二、F因子

●F因子

●Hayes提出在E.coli两个品系间遗传物质的转移是通过一个SexfactorF（致育因子）介导进行的。

携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F＋表示。

未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F－表示。

现在已经证实F因子是一种质粒，大

●约包含100个基因。

●F因子的遗传结构

●1）原点：

转移的起点；

●2）形成接合管的基因群：

与接合有关；

●3）DNA复制酶基因：

与自我复制有关；

●4）插入序列：

与其插入细菌染色体的过程有关。

在细菌接合过程中接合管连接F+和F-细胞。

●根据F因子存在的方式，E.Coli可以分为4种菌株：

●F-菌株：

不带有F因子的菌株，作为受体接受遗传物质。

●F+菌株：

带有F因子的菌株，作为供体提供遗传物质。

●Hfr菌株：

高频重组菌株，F因子通过配对交换，整合到细菌染色体上。

●F’菌株：

带有F’因子的菌株，既可转移供体的染色体片段又可转移F因子。

●细菌接合重组的特点:

●1）F-受体细胞只接受供体的部分染色体，这样的细胞称为部分二倍体。

在这种部分二倍体细胞中，供体提供的部分基因组称为外基因子，而受体提供完整的基因组，受体完整的基因组统称内基因子。

这种重组不同于真核生物的完整二倍体重组。

●2）如果内外基因子之间发生单交换，则环状染色体被破坏，形成的线状染色体不能复制，因而含有这种线状染色体的细胞不能繁殖。

3）偶数次交换才能产生有活性的重组子和线状片段。

线状片段不能复制，随着细胞分裂而被丢失。

因此不会出现相反的重组子。

三、中断杂交与重组作图

1、中断杂交实验法：

（Wollman&Jacob，1950）

Hfr：

thr+leu+azirtonrlac+gal+strs，

F-：

thr-leu-azistonslac-gal-strr

中断杂交实验的步骤

遗传分析要求鉴别重组受体，所以需要用一种方法排除供体细胞。

一般的方法是选用带有选择标记的F-受体。

选择标记是指在中断杂交实验当中，通过生长条件所选择的转移标记（如thr+和leu+）；反选择标记则指用来阻遏供体生长的标记（如strs）。

结果发现Hfr的未选择性标记基因进入F－所需时间：

分种转移的Hfr基因

＜90

9azir

11azirtonr

18azirtonrLac+

25azirtonrLac+gal+

从Hfr菌株的基因在F－细菌中出现开始，随着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一百分数为止。

基因出现的时间愈早，它所达到百分数也愈高。

上述四个基因在混合后24分钟内，以一定的顺序和时间间隔，先后从Hfr进入

F－的细菌中去。

幻灯片45

染色体从一端开始，这一端称为原点（origin）或O，以线性方式进入F－细胞中，基因离开原点越远，进入F－细胞越迟。

根据中断杂交技术，用杂交后Hfr基因最初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以作连锁图。

这里距离的单位是分钟，如ton在azi开始进入F－细胞后2分钟进入，那么azi和ton相隔2单位。

0510152025

azitonLacgal

如果让Hfr×F－杂交继续进行，长达二小时然后使之中断，发现某些F－受体转变为Hfr。

这说明Hrf的全部基因已转移完毕，排在最后的F因子最后转移到受体，使它成为供体，但效率很低，是线性染色体的最后一个单位，我们可得下图：

0azitonLacgalF

大肠杆菌的染色体呈环形

Wollman和Jocob用不同的Hfr菌株进行中断杂交试验，都可作成连锁图，可是基因转移的顺序、转移起点和转移方向都很不相同：

HfrHOthrprolacpurgalhisglythiF

1OthrthiglyhisgalpurlacproF

2OprothrthiglyhisgalpurlacF

3OpurlacprothrthiglyhisgalF

AB312OthithrprolacpurgalhisglyF

规律：

任一行中任何一对相邻的基因在其他各行中也是相邻的。

例如：

his基因总是一边为gal，另一边为gly。

每个Hfr菌系

的基因排列顺序都是相同的，所不同的是O点的位置都有改变，基因转移的方向不尽相同，致育因子（F）最后转移。

结论：

1）F因子的插入方向将决定Hfr染色体的极性。

2）插入F因子的一端将是origin（原点），

从原点Hfr染色体的转移开始；在F因子的另一端为终止点（terminus）可能并不被转移，除非整个染色体都被转移。

2、重组作图法

1）适用范围：

在中断杂交试验中，根据基因转移的

先后次序，以时间为单位求出各基因间

的距离－－时间单位法。

两基因转移时

间间距小于2分钟时，中断杂交法的图距

不精确，应采用传统的重组作图法。

2）原理

如果两基因紧密连锁，那么在知道这两个基因转移的先后顺序的前提下，后转移进去的基因发生了重组，那么先转移进去的基因一定也已经转移进去。

在此基础上，用选择性培养基进一步挑选重组子中的重组子。

3）Hfr：

lac+ade+Strs

F-：

lac-ade-Strr

混合培养用含有Str的基本培养基挑出ade+Strr重组子再用EMB培养基区分lac+和lac-

注：

在含有链霉素的基本培养基上，Hfr细菌被杀死，因其为strs。

未杂交的F－也死亡，因为是ade-。

所以选出来的重组子都是ade+strr。

因为ade+是在Lac+之后进F－细胞，所以我们选出的F－：

ade+strr一定是由同时得到Lac+和ade+的部分二倍体起源的。

lac+ade+

lac-ade-外基因子

内基因子

F-：

ade+lac-，则说明基因间发生交换，为重组子中的重组子。

lac+ade+

lac-ade-

lac-ade+

重组值计算

lac-ade之间的图距为：

（Lac-ade+）（Lac-ade+）

（lac+ade+）+（lac-ade+）ade+

注：

选择在腺甘酸缺乏的培养基上生长的类型。

它们表明ade基因已转入细胞。

选出的lac-ade+类型即是重组子，而lac-ade+表型就是lac和ade发生交换的结果。

可用此来计算重组值。

中断杂交作图与重组作图结果的关系

用时间单位法测得这两个基因间的距离是1分钟，用重组法测得的重组值是20％。

用重组率（RF）所测得的基因间距离与用中断杂交以时间（T）为单位的基因间距离基本上是一致的。

它们之间关系大约是1min等于20个图距单位（cM）。

所以大致上是1个时间单位（1分钟）相当于20％重组值。

大肠杆菌染色体全长约100min，含4×106核苷酸对，所以总图距相当于2000cM，故1cM≈2000bp。

这种接合重组作图在短距离内是有效的。

四、F’因子与性导

F'因子：

能使Hfr转变为F+，F'因子

能整合，能切离，是带有部分细

菌染色体的F因子。

性导：

利用F'因子形成部分二倍体

，叫做性导。

五、转化与作图

1、转化

1928年，Griffith的肺炎双球菌转化实验

1944年，Avery的单因子转化实验

粗糙型肺炎双球菌光滑型的DNA光滑型

转化：

细菌细胞摄取周围游离的外源DNA片段，通过同源区段的交换而实现基因重组。

进行转化的一般步骤：

1）提取供体的DNA并进行纯化；2）断裂成小的双链DNA片段；

3）加到受体细菌的培养液中。

供体的DNA片段被受体细胞所接受，同源区发生重组最后使受体基因型发生变化。

双链DNA的转化过程

在转化时：

①一般要对受体细胞进行处理：

化学处理或用强电场处理（电穿孔）。

目的是增加受体细胞膜对供体DNA的可透性。

②制备感受态细胞：

能吸取DNA分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞。

在某一细菌群体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因子，可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶，它参与DNA的吸收。

2、转化与作图

通过转化可以测定基因连锁、基因顺序和图距。

1）基因连锁关系的确定

相距很远的二个基因很难同时存在于一个DNA片段中，若两个基因的二个片段同时进入受体，一般不能同时进行转化的。

两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体里——共转化（cotransformation），共转化的基因一般是连锁的。

（见图8.21）

2）基因顺序的确定

例如：

如果基因p和q常常一起传递到受体，这样两个基因可能是相对地紧密连锁，同样基因q和基因o也经常一起传递到受体细胞。

这两个基因也是彼此连锁的。

理论上这3个基因有两种可能的顺序：

p-o-q和p-q-o。

若顺序是p-o-q，这样p和o必将共转化,因为它们比p和q靠得更紧密。

结果表明没有p和o的共转化，说明基因顺序肯定是p－q－o。

（见图8.4）

3）图距的测定

例1：

在一个转化实验中，用a+b+品系的供体DNA，转化基因型ab的受体品系，得到的转化类型和数目：

a+b+307

a+b215

ab+278

转化子的总数是800，（用a+作为选择）问b位点与a位点共转化的频率是多少？

解：

a+基因与b+基因共转化的频率用整个a+转化子数目以及a+和b+转化子数目的值来计算。

a+b+共转化子数307，a+转化子有两种a+b+（307）和a+b（215）总数是522。

ab+类型与所提问题不相关，因为对于a+来说它们不是转化子，所以a+和b+共转化的频率是：

307/522×100％＝58.8%

例2：

用枯草杆菌的一个菌株trp2+his2+tyr1+作供体，提取DNA，向受体trp2-his2-try1-菌株进行了转化，得到转化子类型如下：

座位转化子类别

trp2＋－－－＋＋＋

his2＋＋－＋－－＋

try1＋＋＋－－＋－

数量11940366068541826001071180

问基因间的重组值如何？

三个基因的次序如何？

解：

在转化体中数目最多的是三个座位同时被转化的类别，这说明trp2、his2和tyr1三个座位在染色体上靠得很近，需要强调的是在计算trp2-his2之间的重组值时，trp2-his2-座位看成没有机会和带有这两个基因的供体DNA片段相遇的细胞，计算时不能考虑（按同样道理相反的——重组子都不能计算在内，即相反的重组子不存在）。

RFtrp2－his2=（3660＋418＋2600＋107）/

（11940+107+3660+418+2600+1180）

＝6785/19905＝34%

RFtrp2－tyr1=（3660＋685＋2600＋1180）/

（11940+107+3660+685+2600+1180）

＝8125/20172＝40%

RFhis2－tyr1=（685+418+107+1180）/

（11940＋3660＋695＋418＋107＋1180）

＝2390/17990＝13%

计算表明，三个基因的次序是trp2his2tyr1

trp2his2tyr1

3413

转化时细菌染色体的重组和接合时的重组一样，相反的重组体不存在，只有双交换和偶数的多交换才有效。

六、转导与作图

转导：

是指以噬菌体为媒介将供体细菌

DNA导入到受体细菌并发生遗传重

组的过程。

普遍性转导：

供体细菌染色体的任何部

分都可以组装到转导颗粒中，从而

可以转移到受体细菌中。

特异性转导：

温和噬菌体进行的转导，

只能转导部分基因。

●普遍性转导与作图

●共转导：

两个基因同时被包装到一个转

●导颗粒，从而一起重组到受体细菌

●的染色体上。

●共转导的频率愈高，表明两个基因在染色体上的距离愈近，连锁愈密切；相反如果两个基因的共转导很低，说明其距离较远。

因此，测定两基因的共转导频率就可以确定基因之间的次序和距离。

二因子作图

供体受体共转导频率

a+b+ab30%ab近

a+c+ac35%ac近，a在bc之间

b+c+bc3%bc远

三因子作图

例如：

供体的基因型为a+b+c+，受体的基因型a－b－c－，在一个三因子转导杂交实验中，将产生各种不同的转导体。

由于两个基因（a+b+或b+c+）共转导的机率和它们之间的距离成反比。

即二基因距离愈近就愈可能被包装到同一个转导子中并共同转移到同一个受体细胞中，形成一个共转导子a+b+。

例：

用E.coli：

trpA+supC+pyrF+供体细胞和trpA-supC-pyrF-作为受体，由P1噬菌体进行三因子转导杂交实验，结果：

转导型数目

supC+trpA+pyrF+36

supC+trpA+pyrF-114

supC+trpA-pyrF+0

supC+trpA-pyrF-453

问：

它们的基因顺序？

共转导频率？

解：

上述三个基因在遗传图上的顺序可以从第3种转导型上立即判断出来，因为它的数目最少（等于0）。

三个基因的次序为supCtrpApyrF。

supC+和trpA+二基因共转导形成第1和第2两种转导型，因此supC和trpA的共转导频率是：

36+114/603=0.25。

同理，supC和pyrF的共转导频率36/603=0.06。

共转导频率愈高说明两基因靠得愈紧，反之则愈远。

第三节细菌同源重组的机制

一、细菌同源重组的特点

二、细菌同源重组的分子机制

一、细菌同源重组的特点

细菌的接合、转化和转导都是同源重组，这种重组不同于真核生物的完整二倍体重组。

细菌的重组是发生在一个完整的环状双链DNA分子和一个单链或双链DNA片段之间，而且没有相反的重组子。

二、细菌同源重组的分子机制

1、RecBCD识别chi序列引发重组

chi位点：

recBCD基因编码酶的识别位点，可以促进附近区域重组。

5’GCTGGTGG3’

3’CGACCACC5’

recBCD：

提供游离的3’单链末端（重组条件）。

1）降解DNA，核酸酶活性；

2）解旋酶活性；

3）ATP酶活性。

2、RecA催化单链同化

RecA：

DNA链转移蛋白

功能：

1）促进SOS反应中的蛋白酶活性；

2）促进DNA的单链与双链DNA分子中的互补链之间进行碱基配对；

条件：

1）ATP；

2）单链DNA。

RecA可使一条DNA单链置换其同源单链的反应称为单链同化。

发生条件：

1）其中一个DNA分子必须有单链区域；

2）其中一个DNA分子必须有游离的3’区域；

3）该单链区域和3’端必须位于这两个分子的互补区域。

一条线性单链或环形单链入侵一条双链DNA分子，会置换与之互补的链。

中间体

中间体

两条双链DNA分子发生单链同化时：

1）要求其中一段含有至少50个碱基的单链区；

2）从线性分子一端进行同化，入侵的单链置换双链DNA中的同源部分；

3）反应到达两个分子都是双链的区域时，入侵链从它的互补链上解离下来，互补链再与被置换链配对。

3、RuvA系统解离Holliday连接点

由ruv基因产物——蛋白质RuvA、B、

C稳定和解开Holliday连接点；

RuvA、B使分支以10-20bp/s速度迁移；

RuvC是核酸内切酶，能专一识别Holliday连

接点，解开中间体。