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细菌和噬菌体的遗传
第五章细菌和噬菌体的遗传
1细菌和病毒遗传研究的意义
生物的简单分类
自然界所有的生物都可以归入真核生物（eukaryote）和原核生物（prokaryote）两大类。
细菌和蓝绿藻属于原核生物。
构成原核生物的细胞是原核细胞。
原核细胞最基本的特征是没有明确的核膜和核结构，也没有线粒体等细胞器，不能进行典型的有丝分裂和减数分裂，只通过简单的裂殖方式增殖。
因此，它们的遗传物质传递和重组的方式与真核生物不同。
病毒是最原始的生物，没有细胞结构，甚至自己不能进行自主分裂，只能在宿主细胞内以集团形式增殖。
遗传学研究从经典水平发展到细胞水平，一个重要的条件是Morgan利用了果蝇这个模式试验材料。
从细胞水平发展到分子水平，有两个必不可少的条件：
（1）对基因的物理结构和化学结构的了解；
（2）以微生物为研究材料。
§1细菌和病毒遗传研究的意义
一、细菌（Bacteria）
细菌是单细胞生物，是地球上最多的一类生物，它占据了地球上大部分的生物干重。
细菌的繁殖非常快，在适宜的条件下，每20分钟就能繁殖一代，从一个细胞裂殖变成两个细胞。
假如以一个细胞为基数，繁殖一代成为2个，繁殖2代成为4个。
繁殖n代，就有2n-1+1个。
一昼夜以24小时计，可以繁殖72代，总个数为271+1＝2.36×1021。
细菌的基因组很小，只有一条染色体，研究起来非常方便。
细菌群体大，即使突变率很低，也很易得到各种不同的生化突变型。
细菌遗传研究的方法：
用液体培养基培养细菌，待其繁殖到一定程度，用吸管吸取几滴培养液，滴到固体的琼脂糖培养基上，用一根灭菌的玻璃棒涂布均匀。
若涂布的细菌浓度很低，单个细胞可以分散开来（图7－2）。
由于每个细胞不移动的裂殖增生，经过大约一夜，每个细胞的后代可达107个，且集合成群，成为肉眼可见的菌落（colony），或称为克隆（clone）。
单个细菌繁殖而成的菌落中，每个细胞的遗传组成都应该是一样的，但可以发生突变，突变后所形成的菌落也会发生相应的变化。
突变有几类：
形态性状突变、生理特性突变、抗性突变。
菌落形状的突变包括菌落的大小、形状和颜色。
如引起小鼠肺炎的野生型肺炎双球菌本来形成大而光滑的菌落，而有一种突变形的菌落小而粗糙。
生理特性的突变主要是丧失合成某种营养物质的能力，称为营养缺陷型。
如野生型细菌可以自己合成色氨酸，可能突变以后就不能合成了，若不在培养基中添加色氨酸，该菌就会死亡。
营养缺陷型可以用不同的选择培养基来检测。
抗性突变主要是指抗药性的突变。
在野生型细菌培养基中加入青霉素（penicillin），可以阻止细胞壁的形成，从而杀死细菌。
但有抗penicillin的菌株，记为penr，对penicillin敏感的菌株（野生型）记为pens。
检测突变的方法——影印法（图7－3）。
①先在一个母板（masterplate）上使细菌长成菌落。
②用一个比培养皿略小的木板，包上消过毒的丝绒。
在母板上印一下，使菌落吸附在丝绒上，再把丝绒印到各种不同成分的培养基上。
（事先应在培养皿的不同方向作好标记）
假如在缺乏色氨酸的培养板上有一个菌落不能生长，则该菌落很可能是色氨酸营养缺陷型，记为try-。
即可在母板上的对应位置挑取菌落，继续培养，供进一步研究。
若在加有penicillin的培养板上能够生长的菌落，一定是penr突变型，可以直接挑取，供进一步研究中。
二、病毒（virus）
病毒比细菌更为简单，也只有一条染色体（单倍体）。
病毒的结构很简单，只有蛋白质外壳和被外壳包裹着的核酸（遗传物质），没有自身进行代谢和分裂所必须的细胞质和细胞器，必须借助宿主细胞的代谢系统才能繁殖自己。
所以，病毒都是寄生性的，它们必须生活在活细胞内。
病毒按寄主可分为：
动物病毒，植物病毒，细菌病毒。
病毒按遗传物质可分：
RNA病毒，DNA病毒。
细菌病毒（Bacterio-phage）又称为噬菌体（phage）。
噬菌体是研究得比较清楚的病毒。
噬菌体侵染细菌后，使细菌不能生长，而在均匀生长的细菌培养板上形成噬菌斑（plaque）。
根据噬菌斑的形态和生长特点可以鉴别不同的噬菌体。
噬菌体按其在宿主细胞中的生活方式又可分为：
温和噬菌体和烈性噬菌体两大类。
表7－1
三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性。
①世代周期短，繁殖块，繁殖系数高。
大肠杆菌每20分钟繁殖一代，噬菌体每小时可扩增百倍。
用它们作为研究材料，可以大大节约实验时间。
②易于管理和进行生物化学分析。
③遗传物质比较简单，用于研究基因结构、功能及表达调控机制比较方便。
细菌和病毒均只有一条染色体（DNAorRNA），结构简单，不必通过复杂的化学分析就可以对基因结构和功能进行精细的研究。
④便于研究基因的突变，因为它们是单倍体，所有的突变都能立即表现出来，没有显性掩盖隐性的问题，也不存在分离问题。
而且数量庞大，突变率很低的突变都能检测到。
⑤便于研究基因的作用，代谢作用旺盛，能在短时间内积累大量代谢产物，便于对其本身及其产物进行化学分析。
⑥可用作研究高等生物的简单模型。
高等生物体内机制复杂，目前还难以进行详细研究，而细菌和病毒结构简单，可作为模型研究，为开展高等生物的遗传研究奠定基础，积累资料。
病毒利用寄主的代谢系统进行繁殖，势必其代谢方式与寄主有相似之处，因此可作为研究寄主的简化模型。
四、细菌和病毒的拟有性过程。
细菌和病毒的遗传物质也可以从一个个体传递到另一个个体，也能形成重组体。
因为这不同于真核生物的有性生殖，被称之为拟有性过程。
实际上，所谓的拟有性过程指的是细菌或病毒获取外源遗传物质的方式或途径。
细菌与细菌之间的遗传物质的交流（拟有性过程）。
有四种不同的方式：
转化、结合、性导和转导。
§2噬菌体的遗传分析
一、噬菌体的结构与生活周期
噬菌体（bacteriaphageorphage）是病毒的一类，结构很简单，基本上由一个蛋白质外壳包裹着一些核酸组成的。
噬菌体的多样性来自于组成其外壳的蛋白质的种类，以及其染色体的类型和结构的不同。
（一）烈性噬菌体（virulentphage）
遗传学上应用最广泛的烈性噬菌体是大肠杆菌（E.coli）的T偶列噬菌体。
它们的结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状。
T偶列和T奇列有些不同，以T2的结构最为典型（图7－4）。
T偶列噬菌体的头部为六角形，染色体为双链DNA分子。
T偶列噬菌体的尾丝附着在E.coli表面时，通过尾鞘的收缩将DNA经中空的尾部注入宿主细胞。
DNA进入宿主细胞以后，随即破坏宿主的遗传物质，并借助宿主细胞的代谢系统，转而合成大量的噬菌体DNA和蛋白质，组装成许多许多新的小噬菌体。
最后使宿主细胞裂解（lysis），一下子释放出数百个子代噬菌体（图7－5）。
这样的噬菌体称为烈性的噬菌体（virulentPhage）。
（二）温和噬菌体（temperatephage）
温和性噬菌体具有溶原性（lisogeny）的生活周期。
这类噬菌体侵入细菌以后，细菌细胞并不马上裂解。
温和性噬菌体有两种类型。
（1）以λ为代表,λ噬菌体侵入细菌后，细菌并不裂解，λ噬菌体的DNA附着于E.coli染色体的gal和bio位点之间的att位点上（attachmentsite），并通过交换而整合到细菌染色体上。
整合以后，就能阻止其它λ噬菌体的超数感染（superinfection）。
整合在寄主染色体中的噬菌体称为原噬菌体（prophage）。
超数感染：
一个细菌受一个以上同种噬菌体感染的现象。
λ噬菌体的DNA被整合以后，既不大量复制，亦不大量转录和翻译。
往往只有一两个基因表达，表达产物作为阻遏物关闭其他基因的表达。
被溶原性噬菌体感染了的细菌称为溶原性细菌（lysogenicbacterium）。
当溶原性细菌分裂成两个子细胞时，λ噬菌体DNA随细菌染色体的复制而复制，每个细胞中有一个拷贝。
原噬菌体通过诱导（induction）可转变为烈性噬菌体，进入裂解周期。
诱导可以通过不同的方式进行，如UV照射、温度改变、与非溶原性细菌的接合等，诱导使阻遏物失活，使噬菌体的其他基因得以表达，促使噬菌体繁殖并进入裂解周期。
（2）P1噬菌体
P1噬菌体感染E.coli以后，不整合到细菌DNA上，而是独立存在于寄主细胞内。
P1DNA可以复制但不裂解宿主细胞，也不影响宿主细胞的正常代谢，但P1的复制可以使宿主的子细胞中也会有P1DNA，而且可以多于一个拷贝。
受P1噬菌体感染的细菌也可以因诱导而进入裂解周期。
二、噬菌体的基因重组
两个基因型不同的噬菌体同时感染一个宿主细胞，叫做混合感染（mixedinfection）或双重感染（doubleinfection）。
共同生存在同一个宿主细胞中的两个噬菌体的DNA也可以发生交换，产生基因重组。
比如，一个噬菌体的基因型是a＋b-，另一个噬菌体的基因型是a-b＋，同时感染同一个宿主细胞，宿主细胞裂解以后，可能释放出基因型为a＋b＋和a-b-的重组体来。
研究最深入的噬菌体突变体是T2噬菌体的r-（rapidlysis速溶性）突变体。
一个正常的T2噬菌体产生的噬菌斑小而边缘模糊，记为r＋，突变体r-产生的噬菌斑大而边缘清晰。
正常的T2噬菌体能感染E.coliB株。
突变型E.coliB株能抗T2的感染，记为B/2株，T2噬菌体的突变型h-又能克服B/2株的抗性，既能侵染B株又能侵染B/2株，形成透明的噬菌斑。
正常T2噬菌体记为h＋，只能侵染B株，形成半透明的噬菌斑。
h-和h＋均能感染B株。
用基因型为r＋h-和r-h＋的两种T2噬菌体同时感染E.coliB株。
这种现象称为双重感染（doubleinfection）。
将双重感染后释放出来的子代噬菌体接种在同时长有B株和B/2株的培养皿内，记录噬菌斑的数目和形态。
h＋r－半透明，大h－r＋透明，小，亲本型。
h－r－透明，大h＋r＋半透明，小，重组型。
h－r－和h＋r＋为重组型。
重组值＝（重组型噬菌斑数/总噬菌斑数）×100%
＝（h+r++h－r－）/（h+r++h－r－+h+r－+h－r+）×100％
不同速溶菌突变型的表现型不完全相同，分别记为ra、rb、rc。
用r－xh+×r+h－获得的试验结果如下表。
表7－2
杂交组合每种基因型的％重组值
h+r－h－r+h+r+h－r－
ra-h+×r+h-34.042.012.012.024/100=24%
rb-h+×r+h-32.056.05.96.412.3/100=12.3%
rc-h+×r+h-39.059.00.70.91.6/99.6=1.6%
根据表7－2的结果可以分别作出3个连锁图。
P155
有四种可能的排列顺序。
P155
四种顺序都是可能的，要确定到底是那一种，还缺条件。
若知道rb和rc之间的距离，就可以推知rb、rc和h的排列顺序。
为此，需作rb+rc×rbrc+。
结果rb与rc之间的距离大于rb与h之间的距离，可知h应位于rb与rc之间，即rbhrc。
至于ra位于h的哪一边，是靠近rc还是靠近rb？
因为T2DNA是环状的，所以两种答案都是正确的。
§3细菌的遗传分析
细菌与细菌之间的遗传物质的交流（拟有性过程）有四种不同的方式：
转化、结合、性导和转导。
一、转化（Transformation）
细菌通过细胞膜摄取周围环境中DNA体段，并通过重组将其整合到自身染色体中的过程，称为转化。
当外源DNA进入宿主后，使宿主产生新的表现型时就能测知转化的发生。
肺炎双球菌转化试验：
肺炎双球菌有两种不同的类型：
①S型，有毒，菌落光滑，又分为SI,SⅡ,SⅢ
②R型，无毒，菌落粗糙，又分为RIRⅡ
1928年，Griffith，做了如下实验：
RⅡSⅢSⅢ加热后RⅡ＋杀死后的SⅢ
当时无法解释这一结果，但可以肯定，加热杀死后的SⅢ型含有某种促成RⅡ转变为有毒型的物质。
1944年，Avery不仅重复了上述试验，而且用从SⅢ型中提取DNA与RⅡ型菌混合在一起，在离体的情况下，也成功地使少数RⅡ型细菌转变为SⅢ型
经多种试验证明，导致这一转变的物质是DNA，这是细菌遗传性状定向转化的第一个实例，也是DNA作为遗传物质的最直接的证据。
但是，并非所有的细菌都能够发生转化，转化是有条件的。
条件包括三个方面：
①受体细胞的生理状态；
②DNA片段的大小，形态和浓度；
③外源DNA片段与受体DNA的同源程度。
（同源是指核苷酸顺序的相似程度。
这里所说的同源是指整个染色体的核苷酸顺序的近似程度，更重要的是所转化的特定范围的核苷酸的顺序。
）
只有那些生理上处于感受态（competence）的细胞（决定转化因子能否进入细胞）才能吸收外源DNA。
感受态与细菌细胞的生长期有关。
并不是细菌在整个生长周期中都能接受外源DNA。
有人认为，DNA合成结束，蛋白质合成旺盛时期的细胞易于吸收外源DNA。
肺炎双球菌和枯草杆菌的感受态都出现在对数期的后期。
外源DNA片段的大小与能否转化有关。
肺炎双球菌要求外源DNA长于800bp，枯草杆菌要求大于16kb。
外源DNA必须是双链结构而且应达到一定的浓度。
对于某一特定的DNA片段来说供体DNA分子的数量与转化率之间有一定的相关。
有实验表明，细胞壁或细胞膜上有固定数目的DNA接受座位，这些座位饱和以前，转化体的数目与DNA浓度呈正相关，一旦这些座位达到饱和状态，增加的DNA便不再影响转化体的数目。
转化过程：
①当受体细胞处于感受态时，符合要求的外源DNA分子可结合在受体细胞表面的几个接受座位上。
最初的结合是可逆的。
稳定结合在这些座位上的DNA分子随后纵长地被细菌所吸收，这是不可逆的过程。
在外援DNA进入细胞的过程中，有核酸外切酶降解其中的一条链，并利用降解过程中产生的能量，将另一条单链拉进细胞中。
②细菌转化过程中的重组：
a：
供体片段与受体DNA联会；
b：
单链的供体片段与受体DNA部分变性部位的一个单链形成双链，置换出受体的一条单链；
c：
完全形成新的双链，但尚有缺口或切刻；
d：
被置换的受体单链被降解；。
e：
杂合双链的形成（通过DNA聚合酶和连接酶）。
f：
通过DNA复制产生稳定的转化子。
摘自盛祖嘉《分子遗传学》P104
供体的单链片段进入细胞后与相应的受体DNA片段联会，二者之间同源性越大，越容易形成杂交双链。
外源的单链DNA在对应位点置换受体DNA的一条链从而完成转化的全过程。
在相应位置上受体的一条单链片段被置换下来，最终被降解。
整合对同源DNA具有特异性，视亲缘关系的远近，整合的频率不同。
转化以后，只有出现了遗传性状的变异，才能得知转化的发生。
由于DNA是以小片段的形式进入的，所以距离很远的两个基因很难同时存在于一个片段中，除非分别包括这两个基因的两个片断同时进入受体，它们一般是不能同时对受体进行转化的。
按照概率原理，两个片断同时转化的概率应该是它们单独转化的概率的乘积，所以这种概率是很低的。
但是，当两个基因密切连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片断中同时被整合到受体染色体中。
因此，密切连锁的基因可以通过转化进行作图。
Nestar等用枯草杆菌（Bacullussubtilis）的一个菌株trp2+his2+tyr2+做供体，提取DNA向受体trp2－his2-tyr2－菌进行转化，结果列于表7－4。
从表中资料可见，经过转化的个体，即转化体（transformant）中，数目最多的是三个座位同时被转化的类别，这意味着所研究的三个座位在染色体上是靠得很近的。
计算trp2和his2之间的重组值时，685个trp2－his2—应当看成是没有机会和带有这两个基因的供体DNA片断相遇的细胞，计算时不能考虑。
同理，计算trp2和tyr1的重组值时不能考虑418个trp2－tyr2－，对于his2和tyr2的重组率时则不考虑2600个his2－tyr2－。
由表中的计算表明，三个基因的顺是trp2his2tyr2。
转化时细菌染色体的重组和接合一样，只有一种重组体，相反的重组体是不存在的，只有双交换和偶数次的多次交换才是有效的。
二、接合（conjugation）
在原核生物中，两个细胞在相互接触过程中，遗传物质从一个个体转移到另一个个体的现象称为接合。
输出遗传物质的个体称为供体（donor），又称为“雄性”。
接受外源遗传物质的个体称为受体（receptor），又称为雌性。
E.coli（大肠杆菌）是遗传学研究中应用最为广泛的细菌。
野生型的E.coli可以在只含有盐类和葡萄糖的简单培养基上生长。
1946年，Leaderberg和Tatum发现E.coli可以通过结合交换遗传物质。
选用两个不同营养缺陷型的E.coli菌株，A和B。
A菌株，met－bio－，需要在基本营养培养基上补充苏氨酸（thr）和亮氨酸（leu）才能生长。
采用多营养缺陷型是为了防止回复突变干扰试验结果。
A和B均不能在基本培养基上生长，但若将A和B在完全液体培养基上培养几个小时以后再涂布在基本培养基上，就能长出一些原养型（met+bio+thr+leu+）的菌落。
细菌的野生型又称为原养型。
换句话说，能够在基本培养基上生长的细菌称为原养型。
这种原养型菌落的出现是转化的结果呢，还是由于两种不同类型细胞直接接触而交换了遗传物质的结果呢？
必须予以鉴别。
因为在培养过程可能有部分细胞死亡放出DNA而发生转化反应。
1950年，Davis设计了一种U型管试验。
在U型管两臂分别放入带有A菌株和B菌株的完全培养液，中间用过滤器隔开，过滤器的孔很小，细菌不能通过，但生物大分子，包括DNA分子可以自由往来。
从U型管的一端使用加压和吸引的方法使培养液和大分子相互混合，但细菌因有滤板相阻，彼此不能直接接触。
待两侧的细胞停止生长后，将它们分别涂布在基本培养基上，在任何一臂内都没有长出菌落。
说明：
两个菌株间的直接接触是原养型细菌出现的必要条件。
这就否定了转化的可能。
1952年，Hages通过实验证明，在结合过程中，遗传物质的转移是单向的。
上例中是A转向B，而不会反向转移。
所以一般可将供体看成“雄性”，受体看成“雌性”。
在结合过程中，到底是什么东西由雄体输入了雌体呢？
F因子。
A菌株之所以能成为供体，是因为它含有一个性因子（sexfactor）又称致育因子（fertilityfactor），简称F因子。
携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示。
没有F因子的菌体称为受体菌，又称雌性，用F－表示。
F因子是双链环状DNA，分子量大约是3.5×106，是染色体外遗传物质，是质粒的一种，在分类学上属于附加体（episome）。
它既能以自主状态存在于细胞质中，又能整合到细菌的染色体内。
F小环与主染色体大环之间发生一次交换就可以插入到宿主染色体中。
F因子整合到E.coli染色体上以后，该菌株就成为高频重组株（Highfrequencerecombination,Hfr），以Hfr表示。
F因子处于自主状态时，可以不依赖宿主细胞的染色体而独立复制（每个F+细胞只有一个F因子）。
据研究，F因子至少包含有15个基因，其中有的基因控制F伞毛（Fpillus）的形成，F伞毛是F+细胞表面伸出的一种长附属物。
F+与F+之间互不理睬，但F+和F－一旦相互接触，F伞毛就变成了两个细胞之间原生质的通道，叫做结合管（conjugationtube）。
F+细胞中的F因子由结合管向F－传递，使F－变成F+。
转移时，F因子中的双链之一被切开，这切开的单链从3'端开始向F－转移，一旦进入F－中就以此为模板，从5'→3'的方向复制，最终形成一个完整的双连环状F因子。
另一条没有切口的完整单链留在供体内作为母板，进行复制，也形成一个完整的F因子。
在接合过程中，F因子的复制是按DNA复制的滚环模式进行的，两个接合产物，即接合后体（exconjugants）都成为F+，各具备一个F因子。
在Hfr中，F因子的复制是与宿主染色体同步进行的。
当Hfr×F－时，Hfr细胞可以把部分甚至全部染色体传递给F－受体，而且当供体和受体带有不同的标记基因时，相互之间的重组频率很高，故而被称为Hfr（Highfrequencerecombination）。
当Hfr与F－相互接触时，整合在宿主染色体上的F因子的复制系统首先活跃起来，由内切酶在FDNA的一端近端部切成单链缺口，细菌染色体以这一小段单链的FDNA为前导，向F－转移。
若时间充裕，整个Hfr细胞的染色体（包括F因子）都可以转入受体细胞，使F－变成Hfr，但这种情况较为罕见。
大多数情况下，只有一小部分细菌染色体转移，结合即行中断，受体细胞仍保持为F－，因为FDNA的绝大部分仍留在供体内，F－得到的仅仅是F因子的一小部分。
值得注意的是：
距离前导FDNA小片段越近的细菌染色体DNA越先转移，越远的越后转移。
当Hfr菌的部分染色体进入F－后，F－细胞中就有一段DNA具有2份拷贝，被称为部分二倍体（partialdiploid）或部分合子（merozygote）。
新转入的DNA片断称为供体外基因子（exogenote），而受体的染色体称为受体内基因子（endogenote）。
外基因子和内基因子可以发生交换而产生基因重组。
部分二倍体中，若发生单数交换是没有意义的，因为单交换使环状的内基因子打开成为线性DNA，这种细胞是不能成活的。
发生偶数次交换才能产生可遗传的重组体（recombinant）和一个片断（fragment）。
片断以后为酶所降解。
这样，重组后的F－细菌不再是部分二倍体，而是单倍体，得到的重组体的类型只有一个，而不是两个，相反的重组体是不能存活的（例如有＋＋，没有――）。
用中断杂交试验作染色体连锁图。
Hfr中的DNA向F－转移时，是从酶切端点开始直线式进行的。
为证明这一点，50年代有人设计了一个著名的中断杂交试验（interruptedmatingexperiment）。
将一个Hfr菌株和一个F－菌株混合在一起进行培养，使之发生接合，
Hfr：
strsthr+leu+azistonAsgalb+lac+
F－：
strrthr-leu-az
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