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标书报告正文汇总

报告正文

（一）立项依据与研究内容

1、项目的立项依据

（1）．研究意义

二十世纪末人类基因组计划初步完成后,国际上已经开始进行人类脑研究计划。

由于人类对自己脑的认识远远不够，如何认识脑、开发脑、保护脑、预防及治疗脑相关性疾病是目前以至相当长期的重要研究领域和方向。

可以说，脑研究将是21世纪医药学研究的金字塔尖。

脑血管相关性疾病是当前国人最主要的致残和病死原因，北方发病率高于南方，而且呈增长趋势，至今仍缺乏有效的预防和治疗药物，因此需要不断的研究新的具有脑活性（脑缺血损伤保护、脑缺血再灌注、脑血管内皮功能调节、抗脑血栓形成、抗血小板聚集、降血粘度、抗氧化、提高脑缺血后SOD活力、离子通道等）的药物及其药用机制。

天然药物在此领域具有重要价值并能够形成自主知识产权。

我们在国内外首次以辽宁地产乌苏里藜芦（Veratrumnigrumvar.ussurienseNakai）为素材，寻找新的、有效的抗栓、降粘生物碱活性成分，并对其进行化学结构和生物活性比较研究，揭示结构与药效关系，研究抗血栓作用机理,为研制新型血栓病治疗剂构筑应用基础，将具有重要的理论和实际意义。

（2）．国内外研究现状

藜芦为百合科藜芦属植物，基原植物为黑藜芦（VeratrumnigrumL）。

我国有毛穗藜芦、光脉藜芦、乌苏里藜芦、毛叶藜芦、狭叶藜芦、天目藜芦、蒜藜芦、小藜芦等10余种[1]，中药藜芦系数种藜芦的干燥根茎。

古方如葛洪所著[肘后备急方]（1955年版）中记载藜芦能治疗“中风不省人事，牙关紧急者”。

中药大辞典亦称藜芦用于“中风失语、头痛、黄疸、疥疮、疟疾、痢疾的治疗及杀虫、催吐等”，提示具有抗栓、降粘作用。

虽然适应症广泛，但以往国内外研究多集中在降血压方面[2]。

国外对该属植物含有的生物碱成分进行了大量的化学研究，国内则研究不多。

至今已证明了近百种甾体和异甾体生物碱的化学结构[3]，但有关此类生物碱的抗栓降粘及结构与药效的比较研究，则至今未见报道。

国外曾用绿藜芦（V.viride）和白藜芦（V.album）生物碱进行了大量降血压实验，并作为降压药物用于临床，后因治疗剂量与中毒剂量距离小，而限制了应用[2,4,5]。

我国学者亦进行了国产几种藜芦的化学及药理学研究[6~12]，但从未将藜芦生物碱用于临床。

90年代以来，国际上对藜芦生物碱的研究渐趋增多，生物活性研究也逐渐扩展到麻醉-离子通道[13]、杀虫[14]、植物酶-基因[15] 、生殖[16]等方面。

我们首次对东北产三种藜芦：

乌苏里藜芦（V.nigrumvar.ussurienseNaikai）、毛穗藜芦（V.maackiiRegel）、光脉藜芦（V.patulumL.）进行了所含生物碱的初步化学研究。

发现：

乌苏里藜芦总生物碱（Vu-A）主要由germine类生物碱组成[17,18,19]，与国外产绿藜芦和白藜芦组成不同[3]（主要由protoveratrine类生物碱组成）；与主要由zygadenine类生物碱组成的毛穗藜芦总生物碱（Vm-A）[20,21,22]及由jervine、veratramine类生物碱组成的光脉藜芦总生物碱（Vp-A）[23]也不相同。

Vu-A（germine类）Vm-A（zygadenine类）

Vp-A（Jervine类）Vp-A（Veratrmine类）

国外绿藜芦和白藜芦主要含有protoveratrine类

随后进行了三种藜芦总生物碱的生物活性试验，结果证明，虽然同为藜芦属植物，但是种的不同除了使分子结构和化学组成相差甚大之外，其使用剂量、活性强度及毒副作用差别更是不容忽视。

例如，使犬血压降低25％以上的给药剂量Vu-A：

1μg/kg，Vp-A：

80μg/kg，Vm-A：

40μg/kg。

半数致死量（LD50）Vu-A：

173.38±17.94μg/kg，Vp-A：

3110±15.01μg/kg，Vm-A：

358±19.11μg/kg。

对呼吸的抑制作用Vm-A＞Vp-A＞Vu-A[24,25]。

通过等效剂量和时效作用比较，可见乌苏里藜芦生物碱（Vu-A）生物活性强、毒副作用低，有独特性，值得深入研究。

我们在上述基础上选择Vu-A为素材，最初亦是降血压研究，并将Vu-A制成200μg/2ml/支的注射剂，在国内首次试用于60例各类高血压病人。

成人200μg/1次／日，发现对多种高血压病疗效显著，因给药剂量适中，毒副作用甚微（有内部资料）。

在临床试用中发现对血瘀性头痛显效，有2名患顽固性头痛达10余年20年患者，须每日大剂量服用去痛片3－4次，与血压无相关性，经应用Vu-A后撤除了去痛片，每周肌注Vu-A1~2次，200μg／次即可维持良好疗效（内部资料，可提供），此结果与中药大辞典中藜芦治疗头痛相吻合，提示对血粘、血凝、血流、缺血有活性。

后来由乌苏里藜芦中分离、鉴定了茋类化合物白藜芦醇（resveratrol）[26]，白藜芦醇对四氯化碳引起的肝损伤和过氧化脂质引起的肝功异常有治疗作用，该活性又与中药大辞典治疗黄疸相吻合[27]。

乌苏里藜芦的临床试用启示我们将目光集中到“中风失语”。

以此为契机，随即进行了乌苏里藜芦总生物碱（Vu-A）对抗栓降粘等活性的深入研究。

如：

Vu-A对正常及血瘀大鼠血液流变学的影响，对家兔血液流变学的影响[28]，对大鼠颈动脉血栓形成的抑制作用[29]，对血小板聚集的抑制作用[29]，对小鼠急性脑缺血存活时间的延长作用，对小鼠尾出血时间的影响，对心肌细胞Ca2+、K+及对红细胞K+、Cl－离子通道的影响[30]，对大鼠中枢儿茶酚胺能神经元的影响[31]，对中枢神经系统的抑制作用[33]，对犬血流动力学的影响[25]及抗幽门螺杆菌作用[34]（新生物碱成分Verapatuline抗幽门螺杆菌使用剂量与青霉素相近，幽门螺杆菌为发生胃溃疡等胃肠疾病的致病菌，此作用与藜芦治疗痢疾的记载有相关性）等研究。

其中多项工作为藜芦属植物生物碱在国内外首次进行的研究工作。

Vu-A在不同动物模型的活性试验中显示了强大的抗栓降粘及其它有益作用，甚有研究价值。

如：

静脉给药测定颈动脉血流阻塞时间（OcclutionTime,OT值），证明有明显的抗血栓形成作用，OT值延长百分率在100％左右，120分钟后仍有一定作用。

降血粘，降粘幅度高达65％，家兔给药3小时后血粘度仍呈下降趋势。

能够延长小鼠尾出血时间，但效用低于降斯匹林（不易引发出血）。

血瘀模型给药后，血小板最大聚集率显著降低。

Uv-A对红细胞膜K+离子电流有抑制作用，并可使Cl－离子通道明显开放，这些均对红细胞变形能力提高有一定影响，红细胞变形能力降低，全血粘度将提高。

Uv-A在抗栓降粘活性方面，即呈现量效性又有时效性，上述活性的内在机制有待深入研究。

乌苏里藜芦资源十分丰富，在辽宁省广有分布。

其生物碱含量较高（0.2%以上），更由于其有效剂量甚低（微克级），其作用强度在中药活性成分中不多见。

以往人们均认为藜芦“有毒”，为“下品”中药材。

而被视为“下下品”的中药砒霜（主含三氧化二砷，As2O3），现用于治疗白血病，每日静脉给药10mg/人，连续二个月，安全显效，关键在于我国学者在As2O3基础研究方面的深入投入而达到创新。

经检测，乌苏里藜芦主要含有20余种生物碱，多为含有多个酯基的germine类异甾体生物碱骨架生物碱，结构复杂。

以往由于总生物碱组成不清楚，虽然应用总生物碱进行活性实验证明药效强大，但是存在化学组成“混合”，则生物活性“混合”，致使药效、作用点、应用剂量及定量检测“含糊”。

以犬给药1μg/kg的低剂量可使血压降低25％以上推测，即使总生物碱20余种成分中的某一种含量很低，在给药后也可能发挥很强的效力或副作用。

因此，要体现乌苏里藜芦的应用价值，必须分别搞清组成总生物碱的20余种成分的分子结构，这同样也是我国中药、天然药物向现代化迈进的难点。

为此，我们对乌苏里藜芦总生物碱进行了初步的分离、纯化，并主要应用二维核磁共振技术结合质谱等波谱技术鉴定了10种生物碱的分子结构，其中2种为新生物碱，并归属了全部碳、氢、氧、氮的化学位移和位置，此项研究达国际先进水平。

另从乌苏里藜芦中首次分离、鉴定了刺孢麴霉碱（echinuline）[35]、橙黄胡椒酰胺（aurantiamideacetate）,[36]及白藜芦醇（resveratrol）等3种茋类化合物（Stilbenes），其中1种是新化合物[26]，活性试验尚待进行。

最近又发现了乌苏里藜芦总生物碱对缺血性脑损伤的保护作用[37]，这些工作为乌苏里藜芦生物碱的深入研究打下了基础。

我们计划强化对乌苏里藜芦总生物碱的化学研究，将余下的10余种生物碱分离、纯化并鉴定分子结构，将20种不同结构的单一生物碱进行抗栓降粘活性的比较研究，揭示其构效关系，找出作用点和规律性，为开发新的抗栓降粘活性药物提供科学的依据。

在结构与药效的比较方面，我们曾与日本富山医科药科大学合作，已经有了一定进展。

如：

在乌苏里藜芦germine骨架的3位存在乙酰基或2－甲基丁酰基，而同时在15位存在2－甲基丁酰基时，心肌产生正变力作用和正变时作用。

但是，若在3位存在藜芦酰基（3，4-二甲氧基苯甲酰基）、15位存在羟基时，反而产生负变时作用[33]。

藜芦属植物生物碱结构多为异甾体胺类反式喹嗪啶分子骨架,与中药贝母生物碱的分子骨架在反式喹嗪啶部分有一致性。

贝母生物碱近年来用于逆转肿瘤细胞多药耐药研究，从功能和化学结构上属新一类多药耐药逆转剂。

异甾体胺类反式喹嗪啶类生物碱的应用价值不容忽视。

贝母生物碱：

目前，临床治疗血栓病均采用抗血小板、抗凝、溶栓、降粘疗法，乌苏里藜芦生物碱已经具备了此四种功能，应用前景令人鼓舞。

2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究目标

对乌苏里藜芦含有的生物碱进行深入分离、纯化、鉴定各单一生物碱的分子结构，搞清总生物碱的化学组成。

各种纯的单一生物碱进行抗栓降粘的比较研究，研究抗血栓作用机理，寻找新的高活性生物碱，揭示乌苏里藜芦生物碱的构效关系，找出作用靶点和规律性。

研究内容

生物碱的分子结构和生物活性研究均以纯生物碱为素材

（1）总生物碱成分的化学结构研究

a.总生物碱的提取与单一生物碱的分离：

由于甾体生物碱分离困难，从甾体生物碱的特性出发，醇提取后，用有机酸成盐（以避免强无机酸成盐使生物碱变化及杂质混入），采用pH分级萃取法，即在酸性、弱酸性、弱碱性、强碱性的pH梯度下，分别提取茋类化合物（Stilbenes）及弱碱性、中等碱性、强碱性生物碱，使生物碱在提取阶段即得到初步分离。

分离采用中性、近弱碱性硅胶（将市售硅胶自行处理）柱层析结合制备型高效液相色谱，高效液相色谱柱选择C8键合而非C18键合柱。

b.各单一生物碱的光谱测定和分子结构鉴定：

由于乌苏里藜芦生物碱为A、B、C、D、E、F六脂肪环稠合体辅以不同取代基，应用各种二维核磁共振谱技术鉴定结构最适宜。

其中应用1H－1HCOSY建立三键间H间的关联，用相敏Relay或TOCSY建立四键以上H间关连；用异核1H－13CCOSY（HMQC）和远程1H－13CCOSY（HMBC），结合1H－1H各阶偶合信息，确定分子骨架；用多量子滤波J谱脉冲系列得到3J1H－1H信息，求得二面角；用NOE差谱、相敏NOE或ROESY得到NOE信息，进而得到核间距；辅以红外、紫外测定；以高分辨质谱、液相－质谱或液相－质谱－质谱确定各化合物的分子组成。

（2）抗血栓与脑活性研究

对各单一生物碱进行整体、离体抗栓、抗血小板及脑活性比较研究，进行构效分

析，从中选出活性强，有其特点的生物碱深入进行作用机制研究。

a.颈动脉血栓试验：

借助体内血栓形成仪，电刺激动物颈总动脉（1.6mA/7’），引发血管内皮细胞损伤、阻塞血流，测定血流阻塞时间（OT值，OcclutionTime），由OT延长%评价各生物碱的抗动脉血栓形成活性。

b.肺动脉血栓试验：

胶原＋肾上腺素诱发小鼠肺动脉血栓形成，观察30分内小鼠死亡率，以生物碱的保护率评价其抗肺动脉血栓形成活性。

c.抗血小板作用试验：

采用离体与整体两种实验模型测定生物碱对血小板聚集的抑制作用----观测生物碱对由ADP诱发的血小板聚集率的减低，求算对血小板聚集的抑制百分率。

d.线栓法阻断大脑中动脉试验：

将经加热成球形的尼龙线头从颈外动脉经颈中动脉插入颈内动脉，造成脑缺血，一定时间后抽出恢复血供，从而造成对脑的缺血再灌注损伤。

测定脑含水量及脑指数、毛细管通透性、SOD、CK及LDH活性测定以及脑组织神经细胞的病理改变，从而了解生物碱对缺血再灌注造成的脑损伤的有益作用。

e.电凝阻断大脑中动脉所致局灶性脑缺血试验：

电凝大鼠一侧中动脉，造成永久性局灶性脑缺血，然后测定生物碱对大鼠行为学改变的影响，对梗塞面积的影响，对病理改变的影响，从而了解药物对脑缺血的改善活性。

（3）抗血栓作用机理研究

由抗血栓与脑活性试验研究中选出的活性强、有结构特点的生物碱深入进行抗血栓作用机制研究

a.对TXA2/PGI2系统的影响：

TXA2（血栓素A2）为血小板聚集诱导剂，PGI2（前列环素）可对抗TXA2血小板聚集作用。

血浆中TXA2与PGI2的比值常用来探讨药物的抗栓作用机制，两种物质均采用防免法测定。

b.对血小板cAMP水平的影响：

cAMP（环化-磷酸腺苷）为公认的第二信使，可介导多种生理学反应，血浆中cAMP水平的增高将使血小板聚集性降低，应用放免法测定。

c.对血小板Ca2+水平的影响：

Ca2+介导着多种生理学作用，多种抗血栓药物通过影响血小板内Ca2+浓度而发挥抗血小板作用。

可应用Rink方法测定，在Quin-2/AM处理的洗涤家兔血小板样品中测定药物对凝血酶引起的细胞内Ca2+浓度增加的抑制作用。

d.对血小板14C-5HT释放反应的影响：

血小板聚集的第一相反应为诱导剂直接作用于血小板受体而引起。

第二相反应为血小板内介质释放（ADP、TXA2、5HT）进一步加剧了血小板聚集。

制备富含血小板血浆（PRP），加入14C-5HT（碳14标记的5-羟色胺）以标记PRP，然后与生物碱温孵，加入诱导剂胶原，按文献方法操作，液闪记数仪测定放射性并计算生物碱对5-HT释放的抑制作用。

5-HT释放的抑制表明生物碱对血小板聚集第二相反应有抑制作用。

拟解决的关键问题

实现总生物碱中各种复杂的生物碱组分的有效分离；确定各种生物碱的分子结构；研究抗血栓作用靶点与作用机理；揭示不同结构生物碱与抗血栓之间的药效关系，寻找新的高效抗血栓降粘活性化合物。

3、拟采取的研究方案及可行性分析。

（1）总生物碱成分的化学结构研究

a.总生物碱的提取与单一生物碱的分离：

总生物碱的提取过程中，采用pH分级萃取法，提取出各部位总生物碱供分离纯化。

分离采用常规正、反相硅胶层析法结合C8键合而非C18键合柱高效液相制备色谱纯化。

b.分子结构鉴定主要以400兆赫核磁共振仪测定各种二维谱，结合质谱（液相－质谱、液相－质谱－质谱法）、红外、紫外光谱法及其它理化分析法。

在已有的工作基础上，提取分离得到的各单一生物碱应用各种二维谱技术结合其它波谱可以鉴定分子结构，并将获得20种纯生物碱供活性研究。

（2）抗血栓与脑活性研究：

以近20种单一纯生物碱进行

a.颈动脉血栓试验：

以体内血栓形成仪进行，电刺激颈总动脉，造成血管内皮损伤，引起血栓并阻塞血流，测定血流阻塞时间（OT值），并计算给药后OT延长%。

由OT延长%评价各生物碱的抗动脉血栓形成活性。

b.肺动脉血栓试验：

注射各种单一生物碱后，iv肾上腺素+胶原，测定iv血小板致凝剂后的死亡率，计算药物保护百分率，并计算ED50。

以生物碱的保护率评价其抗肺动脉血栓形成活性。

c.抗血小板作用试验：

离体试办验----枸橼酸钠抗凝血，按常规离心得PRP（富含血小板血浆）和PPP（贫血小板血浆），按Born法，以PRP调透光度0%，PPP调调透光度100%。

在PRP中加ADP（血小板聚集诱导剂）一定浓度，用血小板聚集仪测定其聚集率。

由生物碱对血小板聚集的抑制作用----观测生物碱对由ADP诱发的血小板聚集率的减低，求算对血小板聚集的抑制%。

整体试验----取大鼠注射生物碱，一定时间（20分）后取血，加枸橼酸钠抗凝血，按上法（离体试办验）离心得PRP及PPP，其后依法进行测定-----。

d.线栓法阻断大脑中动脉试验：

按文献方法将经加热成球形的尼龙线头从颈外动脉经颈中动脉插入颈内动脉，造成脑缺血，一定时间后抽出恢复血供，从而造成对脑的缺血再灌注损伤。

测定脑含水量及脑指数、毛细管通透性、SOD、CK及LDH活性测定以及脑组织神经细胞的病理改变。

d.电凝阻断大脑中动脉所致局灶性脑缺血试验：

按文献方法电凝大鼠一侧中动脉，造成永久性局灶性脑缺血，然后测定生物碱对大鼠行为学改变的影响，对梗塞面积的影响，对病理改变的影响。

采用的活性试验模型为国内外公认的方法，能够对各单一生物碱作出可靠的评价。

（3）抗血栓作用机理研究：

抗血栓活性试验中选出活性强、有结构特点的生物碱深入进行抗血栓作用机理研究

a.对TXA2/PGI2系统的影响：

TXA2（血栓素A2）为血小板聚集诱导剂，PGI2（前列环素）可对抗TXA2血小板聚集作用。

血浆中TXA2与PGI2的比值常用来探讨药物的抗栓作用机制，两种物质均采用防免法测定。

b.对血小板cAMP水平的影响：

cAMP（环化-磷酸腺苷）为公认的第二信使，可介导多种生理学反应，血浆中cAMP水平的增高将使血小板聚集性降低，应用放免法测定。

c.对血小板Ca2+水平的影响：

应用Rink方法测定，在Quin-2/AM处理的洗涤家兔血小板样品中测定药物对凝血酶引起的细胞内Ca2+浓度增加的抑制作用。

d.对血小板14C-5HT释放反应的影响：

制备富含血小板血浆（PRP），加入14C-5HT（碳14标记的5-羟色胺）以标记PRP，然后与生物碱温孵，加入诱导剂胶原，并按文献方法操作，液闪记数并计算。

4、本项目的特色与创新之处。

在国内外首次进行乌苏里藜芦生物碱的分离、纯化和分子结构鉴定研究。

乌苏里藜芦单一生物碱进行抗血栓、缺血性脑损伤的保护作用研究、构效关系研究、此类生物碱的抗血栓作用机制研究，在国内外均为开拓创新性研究工作。

5、年度计划及预期研究结果。

2004年1－12月对乌苏里藜芦总生物碱进行提取、分离、纯化；纯生物碱进行

二维核磁共振及质谱等光谱测定，解析谱图并鉴定分子结构。

以各种纯生物碱进行抗血栓试验。

预期进展：

完成分离工作，得到约20种生物碱，10种以上可以完成分子结构鉴定。

总结出抗血栓据，统计处理，分析所试生物碱结构与活性关系。

2005年1－12月继续分子结构鉴定，进行抗血小板聚集、脑缺血损伤保护实验。

预期进展：

完成全部分子结构鉴定工作和活性测定实验。

总结、分析分子结构与抗血栓、抗血小板聚集及脑缺血损伤保护的关联性，统计学处理。

2006年1－12月进行抗血栓作用机理实验研究。

预期进展：

揭示生物碱抗血栓作用靶点及其TXA2（血栓素A2）、血小板cAMP水平、血小板Ca2+水平、血小板14C-5HT释放反应间的相关性，进行综合归纳、分析并做统计学处理。

揭示构效关系，提出高活性生物碱的分子结构作为应用素材。

预期结果：

撰写6～10篇学术论文在国内外核心刊物发表；

新结构新活性申请国家发明专利。