选择材料及预处理.docx
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选择材料及预处理
选择材料及预处理
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：
选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：
（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；
（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：
将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：
先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。
对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：
将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：
有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。
常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。
如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。
所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。
常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。
应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。
另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。
Diaflo超滤膜的分子量截留值：
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径
XM－300
300，000
140
XM－200
100，000
55
XM－50
50，000
30
PM－30
30，000
22
UM－20
20，000
18
PM－10
10，000
15
UM－2
1，000
12
UM05
500
10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。
然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。
当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。
这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
二、干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。
真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。
在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。
操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。
此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。
干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。
蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。
此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。
核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。
但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.
一、污染原因
（一）标本间交叉污染:
标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
（二）PCR试剂的污染:
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
（三）PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
（四）实验室中克隆质粒的污染:
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.
二、污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.
对照试验
1.阳性对照:
在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）.但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.
2.阴性对照:
每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:
被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:
在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
三、防止污染的方法
（一）合理分隔实验室:
将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区.其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.
（二）吸样枪:
吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.
（三）预混和分装PCR试剂:
所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.
（四）防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.
（五）设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.
（六）减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.
（七）选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.
PCR扩增产物的分析方法
∙微孔板夹心杂交法
∙颜色互补分析法
∙PCR-ELISA法
∙PCR-OLA法
∙PCR-打点杂交法
微孔板夹心杂交法：
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次杂交，漂洗后显色即可判断结果。
该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。
该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。
此法的敏感性和特异性与PCR32P探针的Southern杂交法相当。
但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。
另一种微孔板杂交法不是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素标记的PCR产物杂交。
微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点：
①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封闭过程。
另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。
微孔板杂交的基本过程包括L：
DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。
DNA的固定
在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。
不同来源的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。
因此，必须用一系列的盐浓度（0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂交。
显色后，判断合适的固定盐浓度。
固定方法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。
用合适浓度的NaCl或（NH4）2SO4可达到此目的。
硫氰酸钠则无固定作用。
盐浓度合适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。
Mg2+虽有促进DNA固定的作用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。
被固定的DNA应大于300bp，否则影响杂交结果。
每孔可固定高达200ng（624bp）的DNA。
合适的盐浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。
与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。
固定液：
10mmol/L磷酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后，终浓度为最适固定浓度）。
用胶布封好，浸于37℃水浴2h。
用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。
立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。
杂交
可采用标准的杂交系统杂交。
夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检测探针一并加。
杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。
显色
根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波长。
颜色互补分析法（A）
颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明）。
如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色）。
如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带。
如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色-黄色带。
如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。
此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿互补的黄色条带。
该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。
这种情况下，只需判断产物的有无。
另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型时，可用复合PCR。
此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM等）。
PCR-ELISA法：
（A）
本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。
因为5’端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。
链霉亲和素的包被：
不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。
亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%（w/v）Tween20，Ph7.2配成1μg/ml。
向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。
用PBS液漂洗。
扩增产物与包被板的结合：
PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。
室温下作用30min。
用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。
ELISA：
向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用30min。
用PBS-Tween漂洗6次。
将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍，向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。
于ELISA计数仪上450nm测定OD值。
另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。
PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。
需注意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。
PCR-OLA法（A）
研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位置。
已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。
所以，一般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。
寡核苷酸连接试验（OLA）就是为此目的而设计的。
它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序列。
OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。
寡核酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。
连接后，通过固相化的亲和配基使其固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。
这一过程如重复进行多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。
此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连接反应，则称之为连接酶链反应。
两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。
另外，连接酶所形成的键是连接产物。
该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋白酶初步处理有核细胞作为检测样品。
需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为例的。
如图2-6中的地高辛标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更易于自动化。
寡核苷酸的设计与标记：
用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于即将连接的两个寡核苷酸接头的5’端。
即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3’端。
左侧寡核苷酸是5’标记生物素。
右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的3’-OH相连接。
用PNK酶处理很易使其5’或3’标记可以选择其它标记物（如荧光素等）。
OLA反应：
向一软质圆底微滴定板内依次加入：
3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA（10μg/μl）;1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。
加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。
加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连接（约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释）。
5X连接缓冲液：
250mmol/LTris-HCl，Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。
不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定最适酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。
混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。
加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。
加入1μl1mol/LHCl中和。
加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用10min。
将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。
再用数毫升1%SDS和0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。
取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。
打点杂交
当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。
这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记的探针杂交。
点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。
放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。
但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验。
因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。
非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度快。
因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。
膜的制备：
点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每一个探针制备1张膜。
然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的PCR产物作探针去杂交。
这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列变异的种类。
显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后一方法仅需一次杂交即可判断结果。
产物的固定：
⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的大小裁剪膜，并做好标记。
⑵将膜浸入水中湿透至少1min。
⑶变性PCR产物：
此步可在圆底微孔板或微量离心管内操作。
每点的变性方法为；5～20μl（50～100ng）PCR产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT）混匀，室温作用5min即可。
⑷小心将预湿的膜装在点样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。
因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融合。
膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真空泵。
⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲液，真空抽滤“洗涤”样品。
⑹取下膜，置于厚3mm滤纸上渍干。
重复制备用于其它基因探针的膜时，一定要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。
⑺渍干的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2的强度下照射使DNA固定在膜上。
此时，的膜可直接用于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。
探针的固定：
因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较困难，即使固定上，也会影响杂交。
这就是需要将寡核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固定。
因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基共价结合，使探针间接地牢固地
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