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毕业论文修改意见
毕业论文-修改意见
LT
中文摘要
本实验旨在研究马齿苋中黄酮类化合物含量测定的方法，为更好的开发利用马齿苋提供依据。
采用美国安捷伦Agilent1200Series高效液相色谱仪等度洗脱，EclipseXDB-C18150x4.6mm,5umcolumnP/N993967-902为色谱柱，甲醇-0.2%磷酸为流动相，流速1.0ml/min，测定波长360nm。
槲皮素进样浓度在0.496—2.48µg/ml（r=0.9994）范围内线性关系良好，平均回收率为98.11%，RSD=0.45%（n=6）。
山奈酚进样浓度在0.448—2.24µg/ml（r=0.9994）范围内线性关系良好，平均回收率为96.92%，RSD=0.63%（n=6）。
该方法准确可靠、重现性好，可用于马齿苋初提液中槲皮素和山奈酚的含量测定。
关键词：
槲皮素；山奈酚；HPLC；等度洗脱
TheStudyonthedeterminationofflavonoidcompoundscontentinpurslaneinDaqingarea
Abstract
Thepurposeofthisexperimentistostudymethodforthedeterminationofflavooidscontentinpurslane,providethebasisforthedevelopmentandutilizationofPortulacaoleraceabetter.BytheUnitedStatesofAmericaAgilentAgilent1200Serieshighperformanceliquidchromatographywithisocraticelution,EclipseXDB-C18150x4.6mm,5umcolumnP/N993967-902column,methanol-0.2%phosphoricacidasthemobilephase,flowrate1.0ml/min,thedetectionwavelengthof360nm.
Quercetinsamplingconcentrationfrom0.496to2.48µg/ml（r=0.9994）thelinearrange,theaveragerecoverywas98.11%,RSD=0.45%（n=6）.Kaempferolsamplingconcentrationfrom0.448to2.24µg/ml（r=0.9994）thelinearrange,theaveragerecoverywas96.92%,RSD=0.63%（n=6）.Themethodisaccurateandreliable,reproducible,andcanbeusedforpurslaneinitialcontentofquercetinandkaempferolinthedeterminationofliquid.
Keywords:
Quercetin;kaempferol;HPLC;isocraticelution
一前言
（一）马齿苋植物学研究
马齿苋（purslaneherb）为马齿苋科植物马齿苋的干燥地上部分，又名长寿菜、五行草、蚂蚱菜等。
全草均可入药，夏、秋采收，除去杂质和残根，洗净，略蒸或烫后晒干。
马齿苋资源丰富，分布于我国各地方。
马齿苋性寒，味酸，具有清热解毒、凉血止痢之功效，在治疗湿疹，丹毒，蛇虫咬伤，热毒血痢，崩漏下血等方面有广泛的应用。
图1.马齿苋图2.中药马齿苋
（二）马齿苋药动学研究
现代药理学研究证明马齿苋具有抑制肿瘤和预防心脏病之作用，其含有的黄酮类化合物能够降血脂、抗氧化、增强胰岛素抵抗。
槲皮素、山奈酚是植物中常见的黄酮类化合物。
（三）槲皮素及山奈酚的研究进展
进来的研究显示，植物界分布最广泛的黄酮类化合物包括槲皮素（图3）及其衍生物，享有“最强的抗癌剂之一”的称号，有着化学预防和治疗肿瘤的双重功效，对多种促癌剂、致癌剂有拮抗作用，且能抑制多类恶性肿瘤细胞生长；山奈酚（图4）能保护神经细胞、抑制蛋白激酶和逆转肿瘤细胞多药耐药性。
其他文献报道的主要是测定马齿苋中总黄酮的含量，如选用超声法和回流法，萃取马齿苋中的槲皮素和山奈酚。
还有实验采用高效液相色谱法分析马齿苋中黄酮类化合物的含量。
由于槲皮素和山奈酚能溶于甲醇，所以在选择提取溶剂时，选择了甲醇。
因此，需要建立了一种同时测定马齿苋中槲皮素和山奈酚的方法。
通过直接扫描法，AlCl3显色法,HPLC法，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH四种方法的比较，最终拟定了HPLC等度洗脱方法，得到较好的分析效果，并且可同时测定同一个样品中槲皮素和山奈酚的含量。
图3.槲皮素图4.山奈酚
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
其特点为高压、高效、高速、高灵敏度、适用范围宽。
根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为液-液分配色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法等。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、反相高效液相色谱、疏水性高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
图5.HPLC色谱仪
二材料与方法
（一）材料
1.仪器
表1.实验所用主要仪器
仪器名称
型号
产地与产家
紫外-可见分光光度计
索氏提取器
超声波振动器
C3860
上海超声仪器厂
电子分析天平
FA-1004
上海精科天平厂
高效液相色谱仪
Agilent1200Series
美国安捷伦
2.试剂
表2.实验所用主要试剂
主要试剂
规格
生产厂家
石油醚
A．R
天津市大茂化学试剂厂
甲醇
色谱纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
水
纯净水
杭州娃哈哈有限公司
磷酸
A．R
天津市大茂化学试剂厂
马齿苋
1
采摘自大庆地区
槲皮素标准品
2
山奈酚标准品
3
（二）方法
1.测定方法的比较
（1）样品的制备
取马齿苋粉末约1g，置索氏提取器中，加石油醚约140ml，提取2h至无色，弃去石油醚，药渣挥去石油醚置锥形瓶中，加入甲醇30ml，超声提取两次，每次40min,超声功率70w，频率20kHZ，温度60℃，滤过，转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，精密量取1ml至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，过0.45µm微孔滤膜，即得。
对照品的制备
取芦丁，槲皮素及山奈酚标准品适量，加甲醇制成0.05mg/ml的对照品溶液，即得。
（2）直接扫描法
取适量芦丁，槲皮素，山奈酚对照品溶液及样品溶液，以甲醇空白为参比，依次在200-00nm范围内扫描。
（3）AlCl3显色法
取芦丁，槲皮素，山奈酚对照品溶液和样品溶液各2ml,分别置于25ml量瓶中，各加1%的AlCl3溶液4ml,用H2O稀释至刻度，使混匀，静置10min后，用试剂空白为参比，在200-600nm范围内扫描。
（4）NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法
精密吸取芦丁对照品溶液及样品溶液各3ml,各置于25ml量瓶中，分别加水至6ml,加5%NaNO2溶液1.0ml,摇匀，静置6min，加10%Al（NO3）3溶液1.0ml,使混匀，静置6min,加10%NaOH溶液10ml,加水至刻度，混匀，静置10min,用试剂空白作参比，在200-600nm范围内扫描。
2.AlCl3显色法的线性关系考察
（1）标准曲线的绘制
将槲皮素配成6.24µg/ml的对照品溶液，依次取0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml分别置于25ml量瓶中，依次加1%AlCl3溶液4ml,用水定容至刻度，使混匀，静置10min后，用试剂空白作参比，在420nm处测吸光度。
以吸光度（A）与浓度（C）做出线性回归方程。
（2）精密度的测定
在420nm处测定样品溶液的吸光度（A）5次，计算RSD。
（3）稳定性测定
在0、30、90、150、210、300min的时间间隔内分别测定样品溶液的吸光度（A），计算RSD。
（4）重复性测定
准确称取马齿苋粉末约1g,5份，测其平均含量和RSD。
（5）加样回收率测试
取已知含量的马齿苋样品5份，依次加入适量的槲皮素对照品，计算加样回收率。
3.HPLC法的线性关系考察
（1）样品的制备
取马齿苋粉末约0.5g,加入甲醇50ml,超声处理（功率80w，频率20kHZ，温度40℃）1h后，过滤，滤液转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，使混匀，即得。
混合对照品溶液的制备
取槲皮素和山奈酚对照品品适量，精密称定，分别加加甲醇制成约0.248mg/ml和0.224mg/ml的溶液，摇匀，即得。
（2）标准曲线的绘制
精密吸取混合对照品溶液适量，进样量分别为0、2、4、6、8、10µl，以峰面积（A）和进样量（µg）做出线性回归方程。
（3）精密度的测定
精密吸取混合对照品溶液，分别连续进样5次，每次10µL，测定精密度。
（4）稳定性测定
精密吸取同一样品溶液，按样品测定方法在0、2、4、6、8、10、12小时的时间间隔内分别进样10µL，测定峰面积，槲皮素和山奈酚的RSD含量。
（5）重复性测定
取马齿苋粉末5份，按“样品的制备”方法制备供试品溶液，测定槲皮素及山奈酚的平均含量及RSD。
（6）加样回收率测试
取已知含量的马齿苋粉末6份，精密称定，各加入5ml的混合对照品溶液，计算加样回收率。
三结果与讨论
（一）测定方法的选择
直接扫描法的结果表明芦丁对照品溶液的最大吸收波长：
nm；槲皮素对照品溶液的最大吸收波长：
nm；山奈酚对照品溶液的最大吸收波长：
nm；样品溶液的最大吸收波长：
nm。
以上四种溶液的最大吸收波长不相同。
NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的结果显示芦丁对照品溶液的最大吸收波长：
nm，但样品溶液的最大吸收未在此范围内。
所以用芦丁作对照品测马齿苋中黄酮类化合物误差大，结果不可靠。
AlCl3显色法结果可看出在420nm处，槲皮素对照品和样品溶液均有最大吸收。
且此方法灵敏度高，操作便捷，节省试剂。
HPLC法灵敏度高，精确度高，分离效能高，并且能连续检测中药中的多种黄酮类化合物的成分。
通过上述四种方法的比较，最终拟定了AlCl3显色法和HPLC等度洗脱方法，得到较好的分析效果，并且可同时测定同一个样品中槲皮素和山奈酚的含量。
（二）AlCl3显色法的方法学考察
1.标准曲线的绘制
以样品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制槲皮素标准曲线，如下：
Y=59.241X—0.0205，r=0．9976，线性关系良好（见图6）
图6.AlCl3显色法的槲皮素标准曲线
2.精密度的测定
在420nm处测定样品溶液的吸光度（A）5次，计算RSD=0.1%，表明精密度良好。
3.稳定性测定
在0、30、90、150、210、300min的时间间隔内分别测定样品溶液的吸光度（A），计算出RSD分别为0.1%、10.6%、13.0%、16.8%、19.0%，表明样品溶液在30min内较稳定，可靠。
4.重复性测定
测得样品溶液的平均含量为0.14%，RSD=2.99%，说明重复性良好。
5.加样回收率测试
槲皮素的平均回收率为100.18%，RSD为0.3%。
表1.槲皮素回收率实验结果
试验号
样品量（g）
样品中槲皮素量（mg）
加入对照品量（mg）
测得量（mg）
回收率（%）
平均回收率（%）
RSD（%）
1
0.1746
0.2445
0.6000
0.8467
100.4
2
0.1589
0.2224
0.6000
0.8204
99.7
3
0.1685
0.2359
0.6000
0.8379
100.3
100.18
0.3
4
0.1811
0.2536
0.6000
0.8555
100.3
5
0.1732
0.2412
0.6000
0.8423
100.2
（三）HPLC法的方法学考察
1.标准曲线的绘制
以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制槲皮素标准曲线，如下：
Y=1083.9X—8.0567，r=0．9994，在0.496~2.48µg/ml范围内线性关系良好（见图7）
图7.HPLC法的槲皮素标准曲线
山奈酚标准曲线：
Y=860.95X—16.472，r=0．9994，在0.448~2.24µg/ml范围内线性关系良好（见图8）
图8.HPLC法的山奈酚标准曲线
2.精密度的测定
精密吸取混合对照品溶液，分别连续进样5次，每次10µL，测得槲皮素的峰面积RSD=山奈酚的峰面积RSD=
3.稳定性测定
精密吸取同一样品溶液，按样品测定方法在0、2、4、6、8、10、12小时的时间间隔内分别进样10µL，测定峰面积，槲皮素的RSD=山奈酚的RSD=。
4.重复性测定
测得槲皮素的平均含量为0.0395%，RSD=2.5%，山奈酚的平均含量为0.04834%，RSD=3.01%。
5.加样回收率测试
槲皮素的平均回收率为98.11%，RSD为0.45%，山奈酚平均回收率为96.92%，RSD=0.63%。
表2.槲皮素回收率实验结果
试验号
取样量（g）
样品中量（ug）
加入量（ug）
测得量（ug）
回收率（%）
平均回收率（%）
RSD（%）
1
0.5006
0.0395
0.248
0.283
98.19
2
0.5101
0.0400
0.248
0.282
97.58
3
0.5108
0.0400
0.248
0.284
98.39
98.11
0.45
4
0.5007
0.0396
0.248
0.282
97.74
5
0.5102
0.0400
0.248
0.283
97.98
6
0.5009
0.0400
0.248
0.285
98.79
表3.山奈酚回收率实验结果
试验号
取样量（g）
样品中量（ug）
加入量（ug）
测得量（ug）
回收率（%）
平均回收率（%）
RSD（%）
1
0.5006
0.0484
0.224
0.264
96.25
2
0.5101
0.0484
0.224
0.265
96.70
3
0.5108
0.0494
0.224
0.268
97.59
96.92
0.63
4
0.5007
0.0484
0.224
0.265
96.25
5
0.5102
0.0484
0.224
0.267
97.59
6
0.5009
0.0484
0.224
0.266
97.14
四结论
通过查阅文献可知，对比马齿苋用盐酸水解和未水解的图谱发现无明显差异性。
显示出马齿苋中含有游离黄酮化合物，所以AlCl3显色法用槲皮素作为对照品分析较为妥当。
本实验表明，用HPLC色谱法对马齿苋进行含量测定精密度高，重现性及稳定性皆良好，方法简便、易行，可作为槲皮素及山奈酚含量的测定方法。
最终拟定了等度洗脱方法。
EclipseXDB-C18150x4.6mm,5umcolumnP/N993967-902为色谱柱；流动相为甲醇一0.2%磷酸（45：
55）；流速为1．0ml/min；检测波长为360nm；柱温为25℃。
精密度较高，稳定性可靠，槲皮素的平均回收率为98.11%，RSD=0.45%，山奈酚的平均回收率为96.92%，RSD为0.63%。
致谢
时光荏苒，岁月如梭，四年的大学生活即将落下帷幕。
在完成毕业论文之际，首先我要向我的导师韩成花老师献上最诚挚的敬意和感谢!
在韩老师的认真指导和殷切关怀、鼓励下，我最终突破了重重障碍，顺利完成了毕业实验。
导师精益求精的治学态度、平易近人的待人方式、无私奉献的敬业精神与勇于创新的科研精神将使我终身获益。
从实验的设计到具体的试验操作再到论文的最终撰写，每一个环节都凝聚了韩老师的辛劳与汗水，也蕴含着老师对我的关心和殷切的期望。
实验的这几个月中，我不仅学到了专业的知识技能，也培养了自己刻苦钻研，永不言弃的科研态度。
虽然过程是艰辛和困难不断涌现的，但我真切地体验到了科研过程中的酸甜苦辣—研究过程中的辛酸与艰难，获得成功时的快乐喜悦与满足成就感。
其次，我还要感谢药学院为我们提供的精密高端的实验仪器设备和严谨优良的实验氛围。
最后，我要向所有关心和帮助过我的老师和学长学姐们献上最诚挚的谢意，是你们让我感受到了前所未有的和谐、融洽、轻松的工作氛围，也让我深深懂得了合作的重要性，实验的顺利完成离不开你们提供的宝贵意见和热心帮助。
祝福你们在今后的人生道路上一帆风顺，越活越精彩！
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