基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用.docx

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基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用

基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用

【摘要】目的：

建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用.方法：

从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果：

20例良性淋巴组织反应性增生病例中,淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例,TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显着意义（）.结论：

应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.

　　【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤

　　0引言

　　恶性淋巴瘤（malignantlymphoma）是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发生于淋巴器官和淋巴组织.根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病及非何杰金恶性淋巴瘤，淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.

　　淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,其抗原受体（Ig和TCR）基因通过基因重排而形成有功能的基因.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化,即可呈现特异的基因重排［1］.因此,对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断.此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨.

　　1材料和方法1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科.其中男性29例，女性24例；年龄12~76岁，平均年龄岁.所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织.其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例.20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照.所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分.3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL（免疫组化标记CD79α阳性）,但诊断仍未明确.2方法石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥.用无菌双面刀片将组织刮入mL的离心管中，按以前的方法［2-3］提取基因组DNA.引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成.引物序列为:

β球蛋白基因内对照PC03：

ACACAACTGTGTTCACTAGC，PC04：

CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排（IgH）FR3A：

ACACGGCTGTGTATTACTGT，LJH：

TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：

GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排（TCRβ链和γ链）Db1:

CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC，Jb2:

AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG:

AGGGTTGTGTTGGAATCAGG，TJX:

CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11:

TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101:

CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:

CAAGTGTTGTTCCACTGCC，Jp12:

GTTACTATGAGCTAGTCC.扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪上进行.反应体系为25μL，含10mmol/LdNTP2μL，10×缓冲液μL，50mmol/LMgCl2　μL，TaqDNA聚合酶1U，20pmol/L引物1μL，DNA样品1~5μL.IgH基因采用半巢氏PCR扩增:

第一轮引物为FR3A和LJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,62℃退火50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.扩增产物经1∶100稀释后取1μL进行第二轮扩增,引物为FR3A和VLJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.FR3A与VLJH扩增产物为100～120bp.

　　TCRβ和TCRγ采用40个循环,其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物.95℃预变性3min,然后94℃变性40s,56℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.TCRβ扩增产物为65～85bp.TCRγ各组扩增产物在70～200bp不等.

　　β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠,共40个循环.95℃预变性3min，然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.产物长度为110bp.电泳及结果观察琼脂糖凝胶电泳评价扩增效果后，将3μL产物和等体积的上样缓冲液［4］混匀后加到厚度为mm的聚丙烯酰胺凝胶，应用miniVE系统泳动8h.取出后按以前的方法［2］银染，分别用UVP凝胶分析系统和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.结果判定阳性结果判定标准：

①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符,与期望值相差

　　不超过5bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.

　　统计学处理：

采用SPSS统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验,以为有统计学意义.

　　2结果

　　组织学观察和免疫组织化学结果32例B细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD20和（或）CD79α阳性,CD3和CD45RO阴性;18例T细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD3和（或）CD45RO阳性,CD20和CD79α阴性,支持原来的诊断和分型.3例未能定性的淋巴组织增生性病变免疫组化标记CD79α阳性,CD3和CD45RO阴性,怀疑为BNHL.20例良性淋巴组织反应性增生病例CD20，CD79α，CD3，CD45RO均有不同程度的阳性表达.

　　A:

CD79а；B:

CD20.

　　图1BNHL组织中CD79а和CD20阳性表达

　　A:

CD45RO；B:

CD3.

　　图2TNHL组织中CD45RO和CD3阳性表达

　　基因重排检测结果

　　石蜡组织标本DNA检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及淋巴瘤组织DNA进行扩增,均见110bp大小的β球蛋白特异条带.

　　右侧泳道为100bpDNA标志物的位置.1：

实验组TNHL.黄色箭头为110bp涌动位置;2：

实验组BNHL；3：

阳性对照TNHL；4：

阳性对照BNHL；5：

反应性增生淋巴组织作为阴性对照.

　　图3PC03/PC04引物PCR扩增结果电泳图

　　良性淋巴组织反应性增生病例结果20例良性淋巴组织反应性增生病变组织B细胞和T细胞抗原受体重排均为阴性.

　　阳性对照T，B淋巴瘤检测结果B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织B细胞Ig重排阳性.T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织T细胞TCRγ1重排阳性.

　　右侧泳道为100bpDNA标志物的位置.1：

IgHFR3A/LJH,FR3A/VLJH引物扩增产物；2：

TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；3：

TCRγ1TVG/TJX引物扩增产物；4：

TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；5：

TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物.黄色箭头为110bp涌动位置.

　　图4良性淋巴组织反应性增生病例PCR扩增结果电泳图

　　左侧泳道为100bpDNA标志物的位置.1：

内对照PC03/PC04引物扩增产物；2：

IgHFR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物；3：

TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；4：

TCRγ1TVG/TJX引物扩增产物；5：

TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；6：

TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；7：

阴性对照FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物.黄色箭头为110bp涌动位置.

　　图5阳性对照BNHLPCR扩增结果电泳图

　　淋巴瘤组织检测结果18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例,TCRβ基因重排为3例,TCR基因重排阳性率%,与良性组相比,差异有显着意义（χ2=,）；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,其中2例TCRγ基因重排也阳性，基因重排阳性率%,与良性组相比,差异有显着意义（χ2=,）.

　　中间泳道为100bpDNA标志物的位置.1：

TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；2：

TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；3：

TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；4：

TCRγ1TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；5：

阴性对照TCRγ1TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；6：

阴性对照TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；7：

阴性对照TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；8：

IgHFR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物.黄色箭头为110bp涌动位置，红色箭头为190bp涌动位置，红色箭头为80bp涌动位置.

　　图6阳性对照TNHLPCR扩增结果电泳图

　　未确诊病例检测结果3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排，经FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现95bp大小IgH阳性条带.

　　3讨论

　　恶性淋巴瘤（malignantlymphoma）是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发生于淋巴器官和淋巴组织.淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化方法很难明确性质，另外NHL种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难［5］.

　　干细胞在向淋巴细胞分化过程中,Ig重链基因（IgH）和T细胞受体（TCR）基因的可变区（V）和结合区（J）基因会发生重排［6］.基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR基因重排，即表现为重排基因为单一模式,这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要［6］.检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.

　　本研究中18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例,TCRβ基因重排为3例,TCR基因重排阳性率%,与Diss等［7］报道的T细胞淋巴瘤%的检出率相近.而良性淋巴组织未见克隆性条带,TCR基因重排检出率在TNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显着意义（）.说明TCR基因引物对T细胞性NHL的克隆性确定有重要价值.32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,基因重排阳性率%,与Kros等［8］报道的B细胞淋巴瘤77%的检出率以及国内王萍等［9］报道的B细胞淋巴瘤72%的检出率相近.而TNHL及反应性增生均未见IgH克隆性基因重排，IgH基因重排检出率在BNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显着意义（）.说明IgH基因引物对B细胞性NHL的克隆性和细胞源性确定有重要价值，可用于淋巴瘤的诊断和分型.

　　B淋巴细胞产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生.我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带，而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带.

　　因此对于淋巴瘤的诊断,首先应依靠形态学检查,并辅以免疫组化结果,对于仍不能明确诊断一小部分病例得,可行基因重排检测，在本研究中有3例较难诊断病例，由于病理HE切片、免疫组化均不能做出明确诊断，通过运用PCR技术对其进行基因重排检测,有IgH的特异性重排条带,提示基因重排的检测对于识别此类交界性及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值.

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