WB实验基本步骤.docx
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WB实验基本步骤
实验基本步骤
提取细胞蛋白
I
BCA定呈
I
制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）
I
蛋白样品变性
I
电泳
I
转膜
I
封闭
I
—抗
I
TBST洗涤
I
二抗
I
TBST洗涤
I
显影
贝脚内容9
结果分析
试剂配制
1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L
磷酸二氢钾0.24g
磷酸氢二钠1-44g
氯化钠8g
氯化钾0.2g
加入500ml纯水，调PH=7.2
定容至1L.高压蒸汽灭菌
2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）
500mlPBS+0.25ml吐温-20
3•电转液500ml
Tris1・5g
甘氨酸7.2g
400ml水溶解
加入100ml甲醇，置于4°C冰箱预冷
4•电泳液（1X）
10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水
5.TBS
6.TBST（TBS+0.05%吐温・20）
50mlTBS+450ml纯水+o.25ml吐温・20
7•封闭液
TBST1X+5%奶粉
40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40C预热
WB实验
一、蛋白样品制备
准备:
一管细胞，PBS（4°C预冷），PMSF（lOOmM）,移液枪（lOOOuL10ul）,1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4°C预冷
1.于-20°C冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液
2.加入lml4°C预冷的PBS（0.01MpH7.2〜7.3）。
用移液枪轻轻吹成悬浮液后4°C,8000r离心5min,然后弃去上淸。
重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。
3.按lml裂解液加10UIPMSF（lOOmM）,摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）
4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后，于4°Cb12000rpm离心5min。
7.将离心后的上淸分装转移倒0.5ml的离心管中放于一20°C保存。
二、蛋白含量的测定（BCA定量）
准备：
96孔板，移液枪（lOOOublOuh200ul）,BCA工作液（A+B）,50mlEP管,lxPBS,BSA标准液1•将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复.（外用一圈的孔最好不用）2•算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B）,（A液：
B液=50:
1,一般配多些，如60扎A液12000uL
B液240ul）3•将样品稀释到一定倍数才能定量,（10倍,20倍,30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul,—般配80ul4•配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0・5mg/ml,若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ulPBS溶液5•将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0.1,2,4,8,12,16,2001加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6•每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差7•将加好的96孔板放在379下孵育30分钟8•孵疗完后,放在酶标仪轻微震荡3・10s冲速,吸光值595nm,进行比色测屯记录标准曲线及样品吸光值数据后，以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。
（R2>0.98才有用，酶标仪操作:
两个箭头图标ZL是结果,2是保存）9•讣算蛋白含量（注意左量样品已经稀释了10倍）
蛋白质定量标准曲线加样量
序号
标准液浓度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5
三、SDS-PAGE电泳
1.配胶（12%,可以提前配好）
准备：
玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4°C冰箱冷藏）
（1）玻璃板验漏5min
（2）按表配置分离胶
（3）灌胶，加酒精封压，凝30min（注意不要有气泡）
（4）按表配浓缩胶，倒掉洒精，用吸水纸吸去洒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min
（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4°C冰箱保存备用
2.样品处理
准备：
PBS,移液枪，1.5mlEP管
（1）稀释样品：
一般每孔上样5ul,即lmg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至lmg/ml
（注意loadingbuffer的加入也得算入）
（2）取出上样样品15ul至1.5ml离心管中，加入6XSDS上样缓冲液3ul至终浓度为IX。
（上样总体积一般不超过15Pl,加样孔的最大限度可加20,样品。
）
（3）将样品在100°C煮5min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）
3.电泳
准备：
电泳液500ml（现配），蛋白胶，20ul移液枪（枪头），样品，Marker,冰盒，电泳装置
（1）将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。
（短玻璃板而向内，长玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一而面向外。
电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。
注意先检漏。
）
（2）上样。
用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸岀不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔.若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
）
（3）先设置80V,开始电泳，样品澳酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至渙酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
（此时准备好电转液）
四、
准备：
电转液（现配4C冰箱冷藏），很子，滤纸，PVDF膜（0.45um）,电转装置，冰盒
注意：
拿滤纸和膜时一过要戴手套或用银子，因为手上的蛋白会污染膜。
1.在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫
2.滤纸浸入电转液中，PVDF膜任甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4°C电转液中平衡至少5min。
3.将夹子打开使黑的一而保持水平。
在上而垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
（一手擀另一手要压住垫子使苴不能随便移动。
）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4.先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
（撬时一左要小心，玻板很易裂。
）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
）
5.将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白而对槽的红而。
一般用100mA转移90min＜；
6.转完后将膜用IX丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
（准备封闭液）
六、免疫反应
准备：
封闭液，一抗，二抗，TBST
1.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
2.TBST洗4次。
每次5分钟。
3.将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h或者4°C过夜
4.室温下孵冇1〜2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min
5.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵ffl〜2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每
次5min
七、显影
准备：
样品胶片，移液枪（200ul）,中枪头，吸水纸，显影液（A+B）,薄银子
一抗
二抗
目的蛋白78kd
Bip1:
1000
兔二抗
目的蛋白34kd
GAPDH内参1:
5000
鼠二抗
28kd
目的蛋白17kd
Sepl51:
1000
兔二抗
2•将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;
2.1min后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用银子夹起来正反而充分和显影液接触，注意切角在左上,即正而朝上。
应注意的是：
显影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
3•盖上盖子，将胶片进行扫描或扌白照。
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