创新实践论文最终版1056田淑睿教材.docx
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创新实践论文最终版1056田淑睿教材
创新实践课程评分表
综述类
项目
分值
得分
积极参加教师科研活动
具有较强动手能力
20
文献资料查阅能力
15
结构、逻辑性
15
文笔流畅
25
内容全面性
15
符合写作规范
10
总分
100
创新实践论文
论文题目：
细胞荧光探针对肿瘤细胞的监测
姓名：
田淑睿
学号：
20121056
学院：
化学化工学院
专业：
药学
指导教师：
应明
细胞荧光探针对肿瘤细胞的监测
作者：
田淑睿
（天津理工大学化学化工学院2012药学1班学号：
20121056）
摘要：
恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的重大疾病之一，是造成死亡的重要原因，随着生存环境的逐渐恶化，其发病率逐年上升。
而肿瘤的早期发现和诊断对其预防和治疗至关重要，研究表明，若在癌症早期能被及时发现并治疗，竟会大大的提高恶性肿瘤的治愈率。
因此，恶性肿瘤的治疗已成为世界各国共同关心的问题。
本文综述了高敏荧光探针对肿瘤细胞的监测，荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用，量子点-CK19抗体荧光探针检测中的应用。
通过荧光探针的监测可以监测癌细胞的位置，并预测其发展趋势。
为合理的选择和正确的临床应用以及科学研究提供参考。
关键词：
高敏荧光探针，流式细胞术,量子点-CK19抗体荧光探针,肿瘤细胞
DetectionofTumorcellsbyFluorescentProbe
shuruiTian
（SchoolofChemicalEngineering,TianjinUniversityofTechnology,Tian
jin,20121056china）
Abstract:
Cancerisoneofthemajordiseasesthatseriouslyendangerhumanhealth.Istheimportantcauseofdeath.Withthegradualdeteriorationofthelivingenvironment,theincidenceofthediseaseisincreasingyearbyyear.Andtheearlydiagnosisanddiagnosisoftumorisvitalforitspreventionandtreatment,Studieshaveindicatedthatthecurerateofmalignanttumorcanbegreatlyimprovedifitisfoundandtreatedinearlystageofcancer.Sothetreatmentofcancerhasbecomethecommonconcernofthecountriesallovertheworld.Themonitoringoftumorcellsbysensitivefluorescentprobeisreviewedinthispaper,Applicationoffluorescenceprobeintumordetectionbyflowcytometry（FCM）,Applicationofquantumdot-CK19antibodyfluorescenceprobefordetection.Thelocationofcancercellscanbemonitoredbyfluorescenceprobemonitoring,Andforecastitsdevelopmenttrend,Providereferenceforreasonablechoiceandcorrectclinicalapplicationandscientificresearch.
Keywords:
sensitivefluorescentprobe,flowcytometry（FCM）,quantumdot-CK19antibodyfluorescenceprobe,tumorcells
前言
恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的重大疾病之一，是造成死亡的重要原因，随着生存环境的逐渐恶化，其发病率逐年上升。
而肿瘤的早期发现和诊断对其预防和治疗至关重要，研究表明，若在癌症早期能被及时发现并治疗，竟会大大的提高恶性肿瘤的治愈率。
因此，对于肿瘤的早期检测和诊治已成为各国科学家关注的热点。
为了实现肿瘤早期诊治，目前研究大多集中于检测活细胞内一种肿瘤标志物，这可能会带来“假阳性”结果。
因为一些肿瘤标志物不但在癌细胞中表达，在正常细胞中也会表达，所以同时检测活细胞中多种肿瘤标志物的表达有非常重要的意义。
肿瘤mRNA作为一种特异性的标志物，呗广泛用来评估癌细胞的转移或者评定癌细胞是否进入了血液循环之中，细胞内的肿瘤mRNA表达水平的变化与肿瘤的恶化程度或转移进程密切相关，通过相互关联细胞间肿瘤mRNA标志物的检测，可以为临床诊断癌症提供新的工具。
荧光成像的方法可以在细胞层面实现无损，高灵敏度的分析，因此具有广泛的应用前景，目前许多荧光探针已经被设计和合成用于检测和成像肿瘤细胞中的mRNA。
在搜索资料和XX查询中了解到功能纳米荧光探针可用于肿瘤细胞检测，该课题组基于金纳米粒子设计了一种多色纳米荧光探针，实现了活细胞内三种肿瘤标志物的同时检测和成像。
该探针成功用于区分乳腺癌细胞、肝癌细胞和正常的乳腺细胞、肝细胞，并能评估肿瘤标志物在细胞中的不同表达水平。
相比较传统的单一标志物检测，该方法可以有效避免可能出现的“假阳性”结果，从而提高癌症早期诊断的可靠性。
有关研究组以聚苯乙烯纳米微球为载体，基于适体特异性识别和DNA杂交原理，组装了一种DNA-CdTe量子点纳米线，制备了具有较高荧光强度的复合型荧光探针，并成功用于hela细胞（宫颈癌细胞）的荧光成像。
该探针可以用于特异性识别肿瘤细胞，在荧光成像中信号强灵敏度高，为肿瘤细胞的检测提供一种新方法.综述了流式细胞术在肿瘤研究过程中荧光探针的开发状况和选择利用.结合使用不同的荧光探针,采用双色、三色乃至多色标记,流式细胞仪可以通过细胞膜抗原分析、细胞周期和DNA倍体分析、细胞凋亡分析等手段鉴定、分型肿瘤细胞,监控肿瘤的发生和治疗过程.通过对不同荧光探针使用上的优势和局限的比较,提出了新一代荧光探针开发方向的建议,以期改善流式细胞术在肿瘤细胞检测中的精度和广度上的局限。
1.高敏荧光探针对肿瘤细胞的监测
荧光成像技术出现后，因其高灵敏度、高稳定性、成本低廉等优点得到了国内外学者的广泛关注，其核心技术——荧光探针更是研究的重点，且已在光学、生物医学等学科中有重要应用。
肿瘤的发生多由基因突变引起，相比于正常细胞，肿瘤细胞的生理特点和形态特征发生明显变化，特别是在分子水平上，例如遗传基因和蛋白质组发生了变化。
往往肿瘤细胞能够合成一些正常细胞内不存在或者含量很低的蛋白质（肿瘤标志物），而这些特征反过来为科研工作者所利用，发展了诸如肿瘤标志物检测、肿瘤ＤＮＡ适体检测等新颖而高效的肿瘤细胞识别检测手段。
这些新的方法技术中肿瘤细胞荧光成像探针的研究成为了近年来的研究热点，肿瘤细胞的研究和癌症的临床诊断都离不开荧光成像技术，该技术的核心内容就是需要赋予荧光成像探针特异识别的能力。
近年来一种被称为DNA适体的特异性识别分子成为了这方面研究的新宠儿，DNA适体[3-6]以其高特异性、高亲和力、无毒、分子量小等优点，自出现后发展迅速，已广泛应用于基础研究、药物开发和临床诊断等领域，其发展势头大有盖过抗原／抗体检测方法的趋势，而实际上DNA适体法不但具备抗原／抗体法的所有优点，而且其分子可设计性、可组装性、灵活多变的功能化特点都是抗原／抗体法不可比拟的[2]。
有关研究以聚苯乙烯纳米微球为载体，利用DNA自组装技术和DNA适体特异性识别技术，组装了一种超分子DNACdTe量子点纳米线，并成功制备了具有较高荧光强度的复合纳米粒子荧光成像探针，该探针可以用于肿瘤细胞的特异性识别及荧光成像检测，具有识别反应迅速、高特异性和荧光信号强度高的特点。
当今，恶性肿瘤已经严重威胁到人类的生命健康，早发现、早治疗对肿瘤疾病的防治起重要作用。
该工作中构建了一种复合型的荧光探针，该探针具有较高的荧光特性，可以放大信号，便于对低浓度细胞的监测，灵敏度很高。
本次实验中用到的识别单元可以很容易的被替换，从而进行其他的检测。
该荧光探针的选择性很好，可以准确区分靶细胞和其他细胞，具有多种功能。
此种荧光探针的成功制备及其应用，表明了它具有制备简单、性质优良等优点，为肿瘤的早期发现和治疗提供了一条新思路，在医学及其他领域具有一定的应用价值。
2.荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用
流式细胞术（FCM）是20世纪70年代发展起来的一种对细胞各种参量,如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质及表面抗原等进行快速测量并分类收集的技术。
随着单克隆抗体技术的发展和荧光探针的开发。
流式细胞术的应用领域也从细胞生物学基础研究扩大到肿瘤学、免疫学、血液学、药物学、临床检测等各个方面。
流式细胞术测量细胞的各种参量必须用荧光探针（即荧光染料）进行标记,所以荧光探针的开发和利用在很大程度上决定流式细胞术的应用范围[1]。
2.1膜抗原的分析
与肿瘤研究有关的膜抗原分析有以下几个方面:
造血系统肿瘤的分型、癌基因表达产物、多药耐药基因的表达产物、肿瘤相关抗原、激素受体、淋巴细胞亚群以及与癌细胞生物行为有关的因子等.膜抗原的检测需要特异性的单克隆抗体,这些抗体被标上各种荧光探针,带有相应抗原的细胞通过单抗与荧光探针相结合,从而在流式细胞仪上可以测出这些膜抗原的表达水平。
细胞外膜抗原的种类很多，仅CD抗原系列就有200多种.每种肿瘤细胞都会有特异性的抗原表达这些特异性抗原的检测就成为判断鉴定肿瘤细胞的证据，细胞用一种荧光染料标记的抗体染色'称为单标记染色但为了更准确地区分肿瘤细胞'需要同时检测两种或两种以上的抗原这就要求使用多种不同发射波长的荧光染料分别标记不同抗体'但是由于流式细胞仪中激光发生器成本高'种类相当有限'而且多色分析要求激发波长种类尽量少以避免对发射波长的干扰'这就要求不同发射波长的荧光染料要有接近的激发波长。
2.2细胞周期和DNA倍体分析
细胞内DNA体积分数是呈周期性变化的。
G2期和M期的DNA体积分数是G1期的2倍.采用特异的DNA荧光染料不仅可以在流式细胞仪上测得细胞周期中各时相细胞所占的百分比,而且还可测出肿瘤细胞的DNA体积分数的相对变化,即DNA倍体分析.流式细胞术对DNA染色一般采用化学染色方法,PI（碘化丙啶）、EB（溴化乙啶）、HO33342（Hoechst33342）、DAPI（4,6-二脒基二苯基吲哚）、7-AAD（7-氨基-放线菌素D）、AO（丫啶橙）、PY（派洛宁丫）等都是常用的核酸染料.分析所得到的DNA直方图上,正常组织表现为一较高的G1峰和一较低的G2峰。
而恶性肿瘤具有染色体数目或结构异常,导致DNA的异常变化,表现在直方图上呈现异倍体峰。
流式细胞仪肿瘤DNA异倍体分析在临床上具有重大意义。
2.3细胞凋亡分析
细胞死亡有两种方式:
细胞凋亡和细胞坏死.细胞凋亡是一种为维持机体自身稳定的“积极主动”的死亡.它在肿瘤发生、发展及治疗中的作用引起了人们的极大关注,诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤学研究的一大热点.流式细胞术因为其简捷、灵敏、直观等特点成为细胞凋亡分析的重要工具。
包括DNA单染色DNA双染色DNA和蛋白质染色细胞凋亡早期事件检测。
流式细胞术作为肿瘤学研究方面的主要手段之一,已广泛应用于肿瘤临床研究,为肿瘤的诊断、疗效评价和预后预测提供了重要的信息.荧光细胞化学技术的进展，以及荧光探针标记的单克隆抗体的开发,为流式细胞术研究各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因开辟了新途径,极大地提高了肿瘤学的研究水平。
但是现在应用的荧光探针仍存在一些问题,例如由于藻胆分子的分子质量很大,难以标记小分子及细胞内抗原或受体,某些核酸染料易造成污染等.流式细胞术应用的开拓需要开发更特异和更敏感的新型荧光探针。
首先,新的荧光探针应该具有更简单的交联方式与配体结合;其次,新的荧光探针不仅仅用于标记单克隆抗体,而且可以同时标记核酸,将核酸与抗原的信息连贯起来；再有,发展能与不同种肿瘤细胞同时结合的荧光探针以提高检测效率。
3.量子点－CK19抗体荧光探针
3.1量子点－CK19抗体荧光探针对肿瘤细胞的监测
量子点是由人工合成的半导体纳米颗粒，又被称为“人造原子”，在光激发下能发出荧光。
医用荧光量子点通常由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成，其晶粒大小为1-10ｎｍ。
与传统的有机荧光染料相比，量子点具有许多优越性。
如尺寸小，可直接进入细胞内部而不对细胞造成损伤；荧光波长的尺寸依赖性和较窄的荧光特征峰，可对不同细胞或单一细胞同时进行多色标记；荧光寿命长；抗光漂白能力强，光稳定性好；良好的表面化学、生物可塑性；生物相容性好。
基于上述特点，量子点荧光标记技术迅猛发展。
将CdTeS量子点与细胞角蛋白19抗体（cytokeration，CK19）结合制备成具有生物靶向性的量子点-CK19抗体免疫荧光探针，实现对乳腺癌细胞的荧光标记，为乳腺癌的早期诊断、肿瘤细胞的定位与成像和靶向治疗提供新的方法和思路。
近年来关于量子点的毒性问题还存在不同的争议。
本研究通过体外实验，检测量子点－CK19抗体探针对乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖和凋亡的影响，从而进一步认识该自主合成探针的细胞毒性[4]。
3．1.1 量子点和探针的光学性质
利用水热法制备的CdTeS量子点[9]，其激发光谱宽而连续，发射光谱窄而对称，在波长555nm附近有一窄而强的荧光发射带。
量子点-CK19抗体探针基本保持了CdTeS量子点原有的光学性质。
与CdTeS量子点相比，量子点-CK19抗体探针的荧光强度有一定的降低，发光峰红移，位于560nm附近。
在紫外光（波长365nm）的激发下，该量子点探针发出黄色荧光。
3.1.2 探针标记MDA-MB-231
荧光显微镜示，在紫外光（波长365nm）激发下，标记上量子点-CK19抗体探针的肿瘤细胞膜及细胞质发出黄色荧光，DAPI标记的细胞核发出蓝色荧光；对照组加入未经-CK19抗体链接的量子点，经过缓冲液的冲洗，去除了溶液中游离的和非特异性吸附在细胞膜上的量子点，因此不能观察到量子点发出的荧光，只能观察到DAPI标记的细胞核发出的蓝色荧光。
通过观察荧光，可以对上皮源性肿瘤细胞进行定位。
在激光共聚焦显微镜下，可以更加清楚地观察到量子点发出的黄色荧光，荧光明亮而清晰，主要定位于细胞质和细胞膜，与定位于细胞核的DAPI的蓝色荧光形成鲜明的对比。
通过双色荧光，细胞和细胞核的形态清晰可辨，这是许多传统的荧光染料所难以达到的。
将观察过的量子点与DAPI双染的细胞爬片置于4℃冰箱保存，之后每隔24h在激光共聚焦显微镜下观察1次，48hDAPI的蓝色荧光已经消失殆尽，而量子点的黄色荧光直到第14天仍然十分清晰。
3.2.量子点作为荧光探针在生物样品检测中的应用
量子点（quantumdots，QDs）作为纳米材料中的一种典型结构，因其独特的理化性质而广受关注。
QDs一般为球形或类球形，是由半导体材料（通常由ⅡB～ⅥB或ⅢB～ⅤB元素组成）制成的纳米粒子，稳定直径为2～20nm。
由于QDs的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。
QDs具有独特的量子尺寸效应和表面效应，与传统荧光染料相比，显示出优良的光谱特征和光化学稳定性。
QDs荧光探针法与其他分析方法相比，更加便捷、成本低、灵敏度高、选择性好。
由于独特的光学性质，QDs已被应用于生物识别及检测中。
本文主要探讨了QDs在生物检测中的主要应用，并对其前景作了展望，为QDs在生物检测领域的进一步开发和应用提供参考。
QDs荧光探针的应用于QDs荧光探针在分子水平，细胞水平，组织水平的检测，分子水平上包括蛋白质的检测，DNA的检测和生物小分子的检测。
Hahn等报道了用QDs免疫探针检测大肠杆菌O157:
H7型[6]。
这是属于QDs荧光探针在细胞水平的检测用于检测微生物。
QDs荧光探针对早期肿瘤的诊断灵敏度较高。
Hu等用PEG修饰的硒化镉QDs实现了细胞表面肿瘤标记物癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）的检测[7]。
这是属于QDs荧光探针在组织水平的检测用于检测肿瘤组织。
但是QDs荧光探针具有细胞毒性。
QDs荧光探针技术最大的挑战就是如何克服其细胞毒性。
但对其毒性及其毒性消除的报道较少。
Mahto等研究了其表面修饰的毒性[8]，发现不同修饰的QDs在细胞中的定位不同。
QDs是一种典型的纳米材料，其粒径比红细胞（6～9um）小得多。
如果研制成QDs纳米机器人注入血管内，其发光特性可清楚地展现体内的状况，可以清除动静脉壁的脂肪沉积，防止动脉粥样硬化的形成；可以疏通脑血管中血栓；清除结石，防止结石病的产生；防止尿酸盐沉积，预防痛风；可以吞噬病毒，清除肿瘤细胞；还可根据其粒径大小，作用于特定的靶位，减少药品的不良反应。
未来医疗有向小型化、便捷化发展的趋势。
QDs作为一种半导体材料可以应用于集成电路，制成的集成电路作为脑起搏器可以调节体内多巴胺的平衡，治疗帕金森病。
此外，该集成电路可应用于心脏起搏器，控制并改善心脏问题[5]。
4.其它
此外有关的科研组做了人乳腺癌特异性基因1mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测试。
建立人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒，并评价其在乳腺癌循环肿瘤细胞检测中的应用价值。
方法优化试剂盒中各组分的浓度、确定试剂盒的稳定性、灵敏度及特异性，并检测外周血样品中BCSG1mRNA的表达水平[3]。
结果优化了试剂盒中的引物、探针，成功制备了定值标准品，通过设立阴、阳性质控品的方法，解决了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等关键技术问题，特异度及准确性均为95%以上，灵敏度为100拷贝/ml（全血）。
外周血标本中BCSG1mRNA的检测结果为，12例临床确诊已转移的乳腺癌患者均为阳性，21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性，其余9例为阴性，15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性。
结论建立的BCSG1mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有很高的临床应用价值，可用于检测外周血样品中BCSG1mRNA的表达量，检测结果可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。
目前，乳腺癌的治疗方法有多种，如手术、放疗、化疗及生物治疗等，但高复发和转移率已成为阻肿瘤患者生存期提高的主要原因。
血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，由于自然或侵袭性医源性因素，癌细胞可从原发灶脱落形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，休眠的癌细胞就有可能被激活,从而导致了乳腺癌的复发和转移[10-11]，循环肿瘤细胞的数量与乳腺癌的进展及患者生存期等密切相关[12]。
若能及早发现并确定循环肿瘤细胞的存在，将对乳腺癌的诊断、预后和治疗产生重要影响，可以指导临床治疗方案的制定。
检测外周血中肿瘤细胞基因及特异性标志物表达是确定肿瘤转移情况的一种有效方法，对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力。
因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。
循环肿瘤细胞中特异性基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。
随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过RT-PCR技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。
实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在[13-14]。
5结语与展望
肿瘤疾病是现在疾病的最大杀手，我们一听到了癌症，那可算是人人敬而远之，谁也不愿给生命判了死刑，我们都不希望这种悲惨的事情发生在我们身上，为此，除了平时多注意自身的身体健康，从自身上防治，但是最重要的还是科学上的进步，肿瘤的早期发现和诊断对其预防和治疗至关重要，若在癌症早期能被及时发现并治疗，竟会大大的提高恶性肿瘤的治愈率。
希望科研人士尽快的运用自己的知识，早日找到发现肿瘤治疗肿瘤的最好方法，让人们远离癌症。
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