净水剂微生物的分离纯化与鉴定.docx

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净水剂微生物的分离纯化与鉴定

一、目的要求[1]

1．通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。

2．掌握常用的微生物鉴定方法及革兰氏染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

3．掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

二、基本原理

1．培养基的配制与灭菌。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。

但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。

配制培养基是不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之间的协调。

此外不同微生物对pH要求不一样，酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。

所以配制培养基时都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。

配制培养基的流程如下：

原料称量→溶解加琼脂熔化调节pH值分装塞棉塞和包装灭菌

由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。

高温的致死作用，主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要大分子发生变性。

高压蒸汽灭菌是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的灭菌方法，本实验同样采用高压蒸汽灭菌。

2．微生物的分离与纯化。

自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

一般是根据微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某些抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。

分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法。

本次毕业设计是从中EPT菌悬液中分离多种有净水功能的菌株，实验将采用稀释平板分离法利用选择性培养基分离菌种。

3．分离菌株的鉴定。

微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、形态、细菌特点及生理生化等方面进行鉴定。

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。

不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和过氧化氢的能力不同。

这些都反映了它们是有不同的酶系统。

细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：

第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。

另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。

三、实验器材

1．菌种：

ETP菌悬液

2．培养基及培养菌种[2]：

A牛肉膏蛋白胨培养基--------------------------ETP菌悬液

B高氏培养基-----------------------------------放线菌

C反硝化细菌培养基试管-------------------------反硝化细菌

D硝化细菌培养基-------------------------------硝化细菌

EMRS培养基------------------------------------乳酸菌

F光合细菌培养基-------------------------------光合细菌

G马铃薯培养基---------------------------------酵母菌

H淀粉培养基-----------------------------------细菌（生理生化鉴定）

I牛肉膏蛋白胨斜面培养基-----------------------细菌（生理生化鉴定）

J明胶培养基-----------------------------------细菌（生理生化鉴定）

3．溶液和试剂：

配制培养基药品（附表）蒸馏水、95%乙醇、香柏油、二甲苯、卢戈氏碘液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，草酸铵结晶紫染液。

4．仪器和其他用品：

普通光学显微镜，电子秤，手提式高压灭菌锅,超净工作台，无菌培养箱，4℃冰箱。

250mL锥形瓶，无菌培养皿，无菌大小试管，无菌1mL移液管，载玻片，胶头滴管，试剂瓶，烧杯。

擦镜纸，酒精灯,接种环，试管架，二甲苯，香柏油，蒸馏水，吸水纸，无菌平板，三角玻棒，玻璃棒,无菌棉塞，药匙等。

四、操作步骤

1．培养基的制备与分装。

（1）称量：

按培养基配方比例依次准确地称取药品。

（2）溶化：

在沸水浴锅中加热熔化。

（3）调pH：

用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培养基所需pH。

（4）分装：

将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装大试管时，注意管口不要沾上培养基。

大试管固体分装装量不超过试管的1/5，灭菌后倾斜放置。

分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，灭菌后垂直待凝。

（5）加棉塞：

培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层报纸。

试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎报纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。

根据上述步骤配制7种培养基，分别编号A-G:

A牛肉膏蛋白胨培养基

B高氏培养基

C反硝化细菌培养基试管

D硝化细菌培养基

EMRS培养基

F光合细菌培养基

G马铃薯培养基

2．无菌水的制备。

用移液管取4mL蒸馏水于6支小试管中，塞上棉塞，包扎报纸。

3．器皿的准备。

（1）培养皿的包装：

每10套一包，用旧报纸包扎。

（2）移液管的包装：

首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。

（3）玻璃涂布棒的包装：

方法同移液管的包装。

4．高压灭菌。

（1）灭菌：

将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间121℃，20min灭菌（MRS培养基中含有葡萄糖等成分，灭菌温度和时间分别为113℃，30min）。

（2）斜面培养基：

灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。

（3）倒平板：

在超净工作台将培养基冷至50℃左右，点燃酒精灯，在火焰旁倒平板。

5．微生物的分离与纯化。

（1）稀释平板分离法：

将5支4ml的无菌水试管排列好，按1/5、10-1、1/15、10-2及1/25、10-3依次编号（由于菌悬液本身浓度不是很高，实验初期采用10-1、10-2、10-3、10-4、10-4、10-5、10-6效果不好，特别是10-5以后基本看不出长菌,。

因此实验采用1:

5稀释）。

在无菌操作条件下，用1ml的无菌移液管吸取1ml菌悬液置于第一支试管中，持移液管吹洗三次，用手摇1分钟将颗粒状样品打散。

即为1/5浓度的菌液。

用l毫升无菌移液管吸取lml1/5浓度的菌液于第二支试管，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-1浓度菌液。

同样方法，依次稀释到10-3。

稀释过程如图

（2）平板的制作

取6套无菌培养皿编号1、2、3、4、5、6，吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。

倒平板

（3）稀释平板涂布法：

由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，如斜面接种技术、液体培养基中的菌种被接入液体培养基、液体接种、穿刺接种、稀释平板涂布法等。

本实验中采用稀释平板涂布法。

稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法（此法接种量不宜太多，只能在0.5ml以下）。

培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。

分别将培养好的细菌、真菌进行平板分离。

分别在适宜温度培养，本实验所用的培养箱的温度是35℃。

（4）菌种保藏（留作鉴定）：

将分离得到的菌种进行斜面保藏。

每株菌保存2支斜面。

5．分离菌株的鉴定。

（1）观察菌种的培养特征。

（2）细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。

<1>制片：

制片方法与简单染色相同。

<2>初染：

加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min，水洗。

<3>媒染：

碘液媒染1min，水洗。

<4>脱色：

连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。

<5>复染：

滴加番红复染1.5min，水洗。

<6>晾干：

将染色好的涂片放空气中晾干，用吸水纸吸干载玻片上的水。

<7>镜检：

镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

<8>实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦干净，a先用擦净纸将油精头上的油擦去。

B用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次。

C再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次。

注意擦镜头是向一个方向擦拭。

②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

（3）细菌的芽孢染色。

<1>制片：

按常规方法涂片、干燥及固定。

<2>加热染色：

向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

<3>脱色：

待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

<4>复染：

用0.5%番红水溶液复染2min。

<5>水洗：

用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

<6>镜检：

镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察芽孢和菌体的形态。

结果：

芽孢呈绿色，菌体呈红色。

（4）查伯杰氏手册[3]，初步对细菌菌种进行鉴定。

（5）进行以下细菌的生理生化试验：

<1>淀粉水解试验

1将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

2用记号笔在平板底部划成4个部分。

3将选取的各菌分别在不同的部分点一下，在平板的反面分别在4个部分标明所接种细菌。

4将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

5观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。

根据透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。

<2>过氧化氢酶试验

①菌体培养：

将各菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，28℃培养24h。

②结果观察：

用接种环各取一小环涂抹于已滴有5℅过氧化氢的玻片上，如有气泡则为阳性，无气泡则为阴性。

<3>明胶液化试验

①接种：

用穿刺接种法接种各菌于明胶培养基中。

②培养：

放20℃恒温箱中培养48h。

③观察结果：

观察培养基有无液化情况及液化后的形状。

五、实验结果

1细菌的形态观察：

2细菌的生理生化试验：

表一：

淀粉水解试验

结果

菌名

实验现象

结论

混合菌液

产生大量气泡

+

放线菌

不产生气泡

-

硝化细菌

产生气泡

+

乳酸菌

光合细菌

酵母菌

符号说明：

在平板上滴加路哥氏碘液呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，记为“+”，称为试验阳性；否则，记为“-”，称为试验阴性。

表二：

过氧化氢酶试验

结果

菌名

实验现象

结论

混合菌液

产生大量气泡

+

放线菌

不产生气泡

-

硝化细菌

产生气泡

+

乳酸菌

光合细菌

酵母菌

符号说明：

试验菌产气泡记为“+”，称试验阳性；否则记为“-”，称试验阴性。

表三：

明胶液化试验

结果

菌名

实验现象

结论

混合菌液

产生大量气泡

+

放线菌

不产生气泡

-

硝化细菌

产生气泡

+

乳酸菌

光合细菌

酵母菌

符号说明：

置于冰箱30min,取出后立即倾斜试管，观察试管培养基的状态，若部分或全部呈液化状态，记为“+”，称为试验阳性；否则，记为“-”，称为试验阴性。

结论：

待测菌分解明胶。

六、附：

本实验用到的各种培养基配方。

A牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏1.25g

蛋白胨2.5g

NaCl1.25g

琼脂4g

水200mL

pH7.0~7.2

121°C灭菌20min

B高氏1号

可溶性淀粉4g

K2HPO40.1g

NaC10.1g

MgSO40.1g

KNO30.2g

FeSO40.002g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.4

C反硝化细菌培养基

KNO30.4g

MgSO40.02g

K2HPO40.1g

酒石酸钠4g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.4

D硝化细菌培养基

NaC10.06g

（NH4）2SO40.1g

K2HPO40.2g

MgSO40.02g

FeSO40.03g

CaCl21.5g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.4

EMRS培养基 

蛋白胨2g

牛肉膏2g、

酵母膏1g

柠檬酸氢二铵0.4g

葡萄糖4g

吐温800.2mL

乙酸钠1g、

K2HPO40.4g

MgSO40.02g

MnSO40.05g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.4

当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。

F光合细菌

酵母膏0.06g

蛋白胨0.2g

NaAC0.4g

NaHCO30,2g

NH4C10.2g

NaC10.2g

KH2PO40.1g

K2HPO40.04g

MgSO40.O4g

CaC120.01g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.6

G马铃薯培养基

马铃薯40g

葡萄糖4g

琼脂5g

水200mL

pH自然

马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至200mL。

110℃灭菌30min。

分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。

H固体淀粉培养基

蛋白胨2g

NaCl1g

牛肉膏1g

可溶性淀粉0.4g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.4

121℃灭菌20min。

J明胶液化培养基

蛋白胨5g

明胶30g

水200mL

琼脂4g

PH7.2-7.4

121℃灭菌20min。

七、参考资料

1.《微生物学实验》第4版，沈萍、陈向东主编，高等教育出版社。

2.《微生物学实验》第一版，赵斌、何绍江主编，科学出版社。

3.《伯杰细菌鉴定手册》第八版，R.E.布坎南、N.E.吉本斯等编，科学出版社。

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