⑹蛋白质的颜色反应
①茚三酮反应:
在弱酸性条件下,蓝紫色(凡具有氨基、能翻出氨的化合物)
②双缩脲反应:
在碱性条件下,紫红色(肽键的反应,故氨基酸无此反应)
③酚试剂反应:
在碱性条件下,蓝色(酪氨酸、色氨酸)
⑺免疫学性质
6.蛋白质的分离与纯化
⑴根据溶解度不同
①等电点沉淀:
蛋白质在等电点时溶解度最小
②盐析沉淀
③低温有机溶剂沉淀:
温度高时可引起蛋白质变性
⑵根据分子大小不同
①透析和超滤:
蛋白质不易变性
②分子排阻层析:
分子量大的先留出柱外(反分子筛效应)
③密度梯度离心:
沉降速度取决于大小和密度,质量和密度大的颗粒沉降得快
⑶根据电离性质不同
①电泳法:
醋酸纤维薄膜电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE);等电聚焦电泳;免疫电泳
②离子交换层析
⑷根据配基特异性
亲和层析:
高度特异性和可逆性
7.蛋白质的纯度鉴定和含量测定
⑴纯度鉴定:
层析纯;电泳纯;免疫纯
⑵含量测定
①克氏定氮法
②福林-酚试剂法:
碱性条件下,生成蓝色化合物(酪氨酸、色氨酸)
③双缩脲法:
碱性条件下,生成紫红色化合物(肽键)
④紫外分光光度法:
280nm(芳香族AA)
⑤BCA比色法
⑥Bradford蛋白分析法
8.蛋白质的分类
根据分子形状球状蛋白
纤维状蛋白
根据化学组成单纯蛋白
结合蛋白:
由单纯蛋白与非蛋白部分(辅基)组成
根据溶解度可溶性蛋白
醇溶性蛋白
不溶性蛋白
根据功能:
活性蛋白;非活性蛋白
真题解析:
1.单选:
酚试剂在碱性条件下,与蛋白分子中氨基酸残基侧链发生氧化还原反应而产生蓝色,以此可作为蛋白含量的基础。
该氨基酸是:
(07年真题)
A.TyrB.ThrC.AspD.Lys
解析:
Tyr(酪氨酸)与Try(色氨酸)可与酚试剂显色。
故选A。
2.判断:
PAGE中影响蛋白质样品迁移率的是分子量和电荷两种因素。
(08年真题)
解析:
正确。
SDS-PAGE中影响蛋白质样品迁移率的是分子量,而与电荷无关。
第四章核酸的化学
1.核酸的概念和化学组成
⑴核酸的概念
核酸DNA主要存在于细胞核中
RNA主要存在于细胞核、细胞质中:
mRNA,tRNA,rRNA(真核中还有HnRNA,SnRNA)
⑵核酸的基本结构单位-单核苷酸
①核酸核苷酸磷酸
核苷戊糖(核糖或脱氧核糖)
碱基嘧啶碱
嘌呤碱
②核酸分子中的糖苷键均为β-糖苷键;核苷中的碱基与糖环平面互相垂直
③RNA和DNA的基本结构单位
RNA的基本结构单位
DNA的基本结构单位
腺嘌呤核苷酸(AMP)
腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)
鸟嘌呤核苷酸(GMP)
鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)
胞嘧啶核苷酸(CMP)
胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)
尿嘧啶核苷酸(UMP)
胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)
④环化核苷酸
⑤辅酶类核苷酸
Ⅰ.辅酶Ⅰ(CoⅠ,NAD)和辅酶Ⅱ(CoⅡ,NADP):
由两个单核苷酸组成
腺嘌呤
尼克酰胺(维生素PP,烟酰胺)
结构中的尼克酰胺部分能可逆地加氢与脱氢,在生物氧化中起递氢作用
Ⅱ.黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD):
腺嘌呤核苷酸+磷酸核黄素(FMN)
在生物氧化中起递氢作用
Ⅲ.辅酶A(CoA):
结构中含有腺嘌呤核苷酸
2.核酸分子的结构
⑴DNA的分子结构
①核酸中核苷酸之间的连接方式:
3',5'-磷酸二酯键,各种简化式的读向都是从左到右,表示碱基序列是从5'到3'(以戊糖为单位)
②真核、原核生物DNA一级结构差异
真核细胞DNA的特点重复序列高度重复顺序
中度重复顺序
单一顺序
间隔顺序与插入顺序
回文结构
原核细胞DNA的特点基因重叠
功能相关的结构基因转录在同一个mRNA分子上
结构基因是连续的
③DNA的二级结构
DNA双螺旋结构模型的要点(B型):
五点
DNA双螺旋结构的稳定因素:
互补碱基之间的氢键;碱基堆积力(最主要);离子键
④DNA的三级结构
在DNA二级结构基础上,双螺旋扭曲或再次螺旋就构成了DNA的三级结构。
超螺旋是DNA三级结构的一种形式。
超螺旋的形成与分子能量状态有关。
⑤染色质与染色体
⑥基因与基因组
⑵RNA的种类和分子结构
①RNA的类型
核蛋白体RNA(rRNA):
在细胞中含量最高,分子量最大
转运RNA(tRNA):
分子量最小
信使RNA(mRNA):
在细胞中含量最少,半衰期最短
细胞内还有一些其他类型的RNA,如细胞核内的不均一核RNA(HnRNA)、核小RNA(SnRNA)和染色体RNA(ChRNA)等
②RNA的结构特征
Ⅰ.RNA的基本组成单位是AMP、GMP、CMP、UMP
Ⅱ.通过3',5'-磷酸二酯键连接
Ⅲ.RNA主要是单链结构,但局部区域可卷曲形成双链螺旋结构
Ⅳ.RNA容易被碱水解(而DNA不易被水解)
③参与蛋白质生物合成的三类RNA的结构
Ⅰ.tRNA的结构
一级结构:
3'-末端为-C-C-AOH
二级结构:
呈三叶草型氨基酸臂:
由7对碱基组成,富含鸟嘌呤
二氢尿嘧啶环:
含有二氢尿嘧啶
反密码环:
环中间是由3个碱基组成的反密码子
额外环:
是tRNA分类的指标
TψC环:
含有T-ψ-C碱基序列
三级结构:
呈倒L型
Ⅱ.mRNA的结构
3'端有多聚腺苷酸(polyA)结构,5'端有帽子结构;分子中有编码区和非编码区;可与核糖体结合成多核糖体。
原核细胞的mRNA的结构特点:
三个
真核细胞的mRNA的结构特点:
三个
Ⅲ.rRNA的结构
RNA分子中形成的发卡结构是RNA具有的最普遍的二级结构形式
3.核酸的理化性质
⑴核酸的分子大小
⑵核酸的溶解度与粘度:
天然DNA分子粘度极大,RNA粘度比DNA小。
当DNA溶液加热,粘度降低,可用粘度作为DNA变性的指标
⑶核酸的酸碱性质:
DNA在pH4~11之间最为稳定,超越此范围,DNA就要变性
⑷核酸的紫外吸收:
由于核酸的组成成份嘌呤和嘧啶碱有强烈的紫外吸收特性,所以核酸在260nm处有最大紫外吸收。
增色效应:
核酸在变性时,e(p)值显著升高
减色效应:
一定条件下,变性核酸可以复性,此时e(p)值又回复至原来水平。
所以,e(p)值可作为核酸复性的指标。
减色效应是由于在DNA双螺旋结构中堆积的碱基之间的电子相互作用,而减低了对紫外光的吸收
⑸核酸的变性、复性和杂交
①变性
Ⅰ.核酸变性时,其双螺旋结构解开,但并不涉及核苷酸间共价键的断裂。
Ⅱ.DNA热变性的过程不是一种“渐变”,而是一种“跃变”过程,即变性作用不是随温度的升高徐徐发生,而是在一个很狭窄的临界温度范围内突然引起并很快完成。
Ⅲ.Tm:
e(p)值达到最高值的1/2时的温度称为“熔点”或溶解温度
Ⅳ.Tm值与其分子中的G-C含量成正比关系;Tm值还受介质中离子强度的影响,离子强度较高时,DNA的Tm值也较高,所以DNA制品不应保存在极稀的电解质溶液中,一般在1mol/LNaCl溶液中保存较为稳定。
②复性:
通常以e(p)值的改变作为复性的指标,DNA在缓慢冷却时才可以复性。
③核酸的杂交
Southern印迹法:
DNA杂交
Northern印迹法:
RNA杂交
Western印迹法:
蛋白质杂交
4.核酸的分离与含量测定
⑴核酸的提取、分离和纯化
⑵核酸含量测定的原理
①定磷法
②定糖法
核糖的测定:
与浓盐酸或浓硫酸作用生成糠醛,再与地衣酚反应生成深绿色化合物;在660nm有最大吸收
脱氧核糖的测定:
与浓硫酸作用后,再与二苯胺反应生成蓝色化合物;在595nm有最大吸收
③紫外吸收法
真题解析:
1.判断:
DNA的二级结构模型分为左手和右手双螺旋结构两大类型。
左手双螺旋结构包括A、B、C、D等类型。
(07年真题)
解析:
错误。
是右手螺旋包括A、B、C三种类型,而左手螺旋是Z型。
2.单选:
一段DNA,碱基A含量为26%,那么碱基G含量是:
(08年真题)
A.52%B.48%C.26%D.24%
解析:
DNA中碱基含量,A=T,C=G,A+T+G+C=100%,故碱基G含量为24%,选D。
第五章酶
1.酶是生物催化剂
⑴酶的生物学意义
①酶的定义:
(注意包括蛋白质和核酸)
②酶的特点:
条件温和;催化效率高;高度专一性;活性可调控;可催化某些特异性反应
⑵酶作用的专一性
①立体化学专一性立体异构专一性
几何异构专一性
②非立体化学专一性键专一性
基团专一性
绝对专一性
诱导契合学说
⑶酶的分类与命名
①酶的分类:
氧化还原酶类;转移酶类;水解酶类;裂合酶类;异构酶类;合成酶类
②酶的命名
例:
E.C2.7.1.1
E.C代表国际酶学委员会,第1个数字代表酶的分类名称,第2个数字代表亚类,第3个数字代表亚亚类,第4个数字代表发现顺序
2.酶的结构与功能
⑴酶的化学组成
①全酶=酶蛋白+辅助因子(辅酶或辅基)
只有全酶才有催化活性
②分类:
单体酶;寡聚酶;多酶体系
⑵酶的辅助因子
①辅酶:
与酶蛋白结合较疏松(一般为非共价结合),并可用透析方法除去
辅基:
与酶蛋白结合较牢固(一般为共价键结合),不能用透析方法除去
决定酶催化作用的专一性和高效性的是酶蛋白部分,而辅酶或辅基决定酶促反应的类型。
辅酶或辅基在酶促反应中主要起着递氢、传递电子或转移某些化学基团的作用。
②分类
Ⅰ.无机金属元素
作用有以下几方面维持酶分子活性构象
传递电子
在酶与底物之间起桥梁作用
利用离子的电荷影响酶的活性,更有利于酶与底物结合
Ⅱ.维生素
脂溶性:
A、D、E、K四族
水溶性:
B族和C族
B族维生素及其辅酶形式(表5-2)的内容需大致了解
Ⅲ.蛋白质类辅酶
主要通过递氢或递电子而起作用
金属离子、铁硫复合体和血红素通常是这些蛋白质类辅酶的反应中心
⑶酶的结构与功能
①酶的活性中心和必需基团
必需基团活性中心或活性部位底物结合部位
催化部位
活性中心外的必需基团
对于需要辅酶或辅基的酶,其辅助因子也是活性中心的重要组成部分
具有相似催化作用的酶往往有相似的活性中心
②酶的活性中心与酶作用的专一性
酶作用的专一性主要取决于酶活性中心的结构特异性
通过空间位阻,形成离子键和疏水作用等实现
③空间结构与催化活性
活性中心需借助于一定的空间结构才得以维持,因此保持活性中心的空间结构是维持酶活性所必需的。
④酶原的激活
机制:
是分子内肽链的一处或多处断裂,同时使分子构象发生一定程度的改变,从而形成酶活性中心所必需的构象。
生理意义:
避免细胞产生的蛋白酶对细胞进行自身消化;并使酶在特定的部位和环境中发挥作用,保证体内代谢的正常进行。
3.酶的作用机制
⑴酶能显著降低反应活化能
⑵中间复合物学说和酶作用的过渡态
底物同酶结合成中间复合物是一种非共价结合
⑶酶作用高效率的机制
①底物的“趋近”和“定向”效应:
“趋近”效应大大增加了底物的有效浓度
②底物变形与张力作用
③共价催化作用
④酸碱催化作用:
影响因素酸碱强度
功能基供出质子或接受质子的速度
⑷核酶与抗体酶
①核酶:
是具有生物催化活性的RNA。
其功能是切割和剪接RNA。
核酶的底物是RNA分子。
②抗体酶:
具有与半抗原特异结合的抗体特性和催化半抗原进行化学反应的酶活性。
4.酶促反应的动力学
⑴底物浓度对酶促反应速度的影响
当酶浓度一点时,考查底物浓度对反应速度的影响(如图1所示)
第一段:
一级反应
第二段:
混合级反应
第三段:
零级反应
①米氏常数(Km)的意义和应用
米氏常数Km的意义:
为酶促反应速度达到最大反应速率一半时的底物浓度,是酶的特征性常数(即当pH、温度和离子强度等因素不变时,Km恒定)。
Ⅰ.同一种酶如果有几种底物,就有几个Km,其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。
一般用1/Km近似地表示酶对底物亲和力的大小,1/Km值愈大,表示酶对底物的亲和力愈大。
Ⅱ.已知某个酶的Km,可计算出在某一底物浓度时,某反应速度相当于Vma的百分率。
Ⅲ.在测定酶活时,[S]值需为Km值的100倍以上。
Ⅳ.催化可逆反应的酶,对正逆两向底物的Km值不同。
Ⅴ.当一系列不同的酶催化一个代谢过程的链锁反应时,可以通过确定酶的Km值的底物浓度寻找限速步骤。
Ⅵ.了解酶的Km值及其底物在细胞中的浓度可以推测酶在细胞内是否受到底物浓度的调节。
Ⅶ.测定不同抑制剂对酶Km和Vmax的影响,可以区别抑制剂的类型。
(注:
Ⅰ、Ⅲ需掌握,其余内容了解即可)
②米氏常数的求法
Ⅰ.双倒数作图法
Ⅱ.Hanes作图法
⑵pH的影响与最适pH
pH对酶反应速度的影响主要有以下原因
影响酶和底物的解离
影响酶分子的构象
⑶温度的影响与最适温度
化学反应速率与酶受热变性的平衡
⑷酶浓度的影响
⑸激活剂的影响
激活剂的作用机制:
①与酶分子中的氨基酸侧链基团结合,稳定酶催化作用所需的空间结构
②作为底物(或辅酶)与酶蛋白之间联系的桥梁
③作为辅酶或辅基的一个组成部分协助酶的催化作用
⑹抑制剂的影响
抑制剂通常对酶具有一定的选择性。
凡是使酶变性失活的因素对酶没有选择性,不属于抑制剂。
①不可逆抑制
抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失,不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活力。
这种抑制作用会随着抑制剂浓度的增加而逐渐增加,最后可完全抑制酶的活性。
Ⅰ.非专一性不可逆抑制:
结合一类或几类基团
Ⅱ.专一性不可逆抑制:
针对特定的基团
假底物:
抑制剂的结构与底物结构类似,这类不可逆抑制剂称为~。
自杀底物:
抑制剂通过酶的作用,使其专一性不可逆抑制功能基团激活,并与酶共价结合,从而抑制酶活性。
②可逆抑制
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失,可用透析等物理方法除去抑制剂,恢复酶的活性。
Ⅰ.竞争性抑制
E+S[ES]PE+I[EI]不存在EIS三联复合体
抑制剂与底物竞争在同一位置:
抑制剂结构与底物结构类似
抑制剂与底物竞争不在同一位置:
酶与任何一方结合后,会阻碍另一方与酶分子结合
动力学特点:
三个
竞争性抑制的经典例子:
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制
Ⅱ.非竞争性抑制
E+S[ES]P
+
I
E+I[EI]+S[ESI]P
动力学特点:
三个
Ⅲ.反竞争性抑制
E+S[ES]P
+
I[ESI]
E+I[EI]
动力学特点:
三个
小结:
抑制种类
Lineweaver-Burk作图法
表观Vmax(Vmaxapp)
表观Km(Kmapp)
斜率
纵轴截距
横轴截距
直线交点
无
Km/Vmax
1/Vmax
-1/Km
Vmax
Km
竞争性抑制作用
增大
不变
增大
纵轴
不变
增大
非竞争性抑制作用
增大
增大
不变
横轴
减小
不变
反竞争性抑制作用
不变
增大
减小
无交点
减小
减小
5.酶的分离、提纯及活性测定
⑴酶的分离、提纯(同蛋白质)
⑵酶的活力测定
①测定酶的活力就是测定酶促反应的速度,在实验中必须确保所测定的是初速度。
②酶活力的高低以酶活力单位(U)表示。
酶活力单位的含义是指酶在最适条件下,单位时间内,酶催化底物的减少量或产物的生成量。
③酶的转换数Kcat:
酶的转换数是指单位时间内,每一个催化中心所转换的底物分子数。
④酶的纯度用比活力表示,比活力即每毫克蛋白(或每毫克蛋白氮)所含的酶活力单位数。
6.重要的酶类
⑴寡聚酶:
两个或两个以上的亚基所组成的酶(亚基可相同,也可不同)。
⑵同工酶:
催化相同化学反应,但分子结构不同的酶。
⑶诱导酶:
当细胞中存在特殊诱导物质时,而诱导细胞产生的酶,或一个诱导物的存在使细胞内特定酶的含量显著提高。
⑷调节酶:
当调节剂与调节酶的调节区结合后,改变酶的空间结构,从而改变酶的催化活性,这种酶称为~。
①共价调节酶:
调节剂以共价键的形式与调节酶的调节区结合
主要化学修饰类型有六种:
磷酸化/去磷酸化;乙酰化/去乙酰化;腺苷酰化/去腺苷酰化;尿苷酰化/去尿苷酰化;甲基化/去甲基化;S-S/-SH
②变构酶:
调节剂以非共价键的形式与变构酶的调节中心结合
变构激活作用与变构抑制作用
协同效应同种效应和异种效应
正协同效应与负协同效应
变构酶的反应初速度-底物浓度关系:
同种效应变构酶:
S型曲线
负协同效应的变构酶:
双曲线
注:
变构酶与调节酶的酶促反应动力学不符合米氏方程;诱导酶与同工酶如属于调节酶的范畴则也同样不符合米氏方程。
⑸固定化酶:
通过物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内,并使酶仍具有催化活性的酶。
特点:
酶被固定化后,使其稳定性得以提升
可以反复使用,提高了使用效率,降低反应成本
可以使酶促反应体系连续化、自动化
极易与产物分离
7.酶在医药学上的应用
真题解析:
1.判断:
变构酶的酶促反应体系存在非竞争性抑制时,反应体系的Vmax减小,而Km不变,而且反应体系的Vmax,会随非竞争性抑制剂浓度的增加而进一步减小。
(07真题)
解析:
正确
第六章激素及其作用机制
1.概述
⑴分类内分泌激素:
作用距离最远,由内分泌细胞将激素分泌到胞外,通过血液循环而作用。
旁分泌激素:
只作用于临近的靶细胞
自分泌激素:
作用于分泌细胞自身
⑵激素的特性
①激素自我合成可调控性
②激素分泌的可调控性
③作用特异性
④作用的微量性
⑤作用通过中间介质
⑥作用的“快反应”和“慢反应”
“快反应”:
通过中间介质直接影响靶细胞浆中的相关一系列酶活性的改变
“慢反应”:
通过中间介质作用于染色体
⑦脱敏:
定义
⑶激素的化学本质和分类
水溶性激素:
肽类激素和肾上腺素
脂溶性激素:
固醇类激素和甲状腺素
2.主要激素的化学与生理生化功能
⑴降钙素:
血钙↓,血磷↓
⑵甲状旁腺素:
血钙↑,血磷↓
⑶胰岛素:
血糖↓
⑷胰高血糖素:
血糖↑
⑸肾上腺肾上腺髓质激素去甲肾上腺素
肾上腺素:
血糖↑
肾上腺皮质激素糖皮质激素:
血糖↑
盐皮质激素
性激素
3.激素作用机制
⑴受体
①定义:
受体、配体、效应器、激动剂、拮抗剂、部分激动剂、反向激动剂
②受体的配对结合的特性:
六点
⑵受体的类型
①细胞膜受体
Ⅰ.G蛋白偶联受体
Ⅱ.离子通道受体
配体门控离子通道:
通过一种配体化学分子调控
电压门控离子通道:
通过膜电位的改变
Ⅲ.具有内在酶活性受体
酪氨酸受体激酶
丝氨酸/苏氨酸受体激酶
受体鸟苷酸环化酶系统
受体一氧化氮
Ⅳ.与酪氨酸酶活性相关的受体
②细胞内受体
⑶细胞膜受体作用机制
第二信使有:
cAMP、cGMP、IP3、Ca2+、DAG、神经酰胺、花生四烯酸、NO
①通过第二信使介导的信号传导
Ⅰ.G蛋白偶联产生的第二信使
i.腺苷酸环化酶系统
激素与受体结合后,引起靶细胞膜上腺苷酸环化酶活性改变,环化酶可催化ATP分解生成cAMP,cAMP作为第二信使,产生生理效应。
由四部分组成受体(膜外侧)
G蛋白(膜内侧)
腺苷酸环化酶(膜内侧)
调控靶细胞腺苷酸环化酶的两种类型激活型
抑制型
cAM