Transwell实验 超详细之欧阳歌谷创作.docx

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Transwell实验超详细之欧阳歌谷创作

Transwell侵袭实验总结

欧阳歌谷（2021.02.01）

第一节概念

这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1.Transwell

关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membranefilters），也可认为是一种有通透性的支架（permeablesupports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwellchamber，Transwellinsert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：

（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

我们实验室用的是0.4µm。

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验

可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：

将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验

常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验

常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

2.肿瘤细胞侵袭模型

用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：

2.1体内癌细胞侵袭模型

2.1.1皮下移植侵袭模型

2.1.2肌肉内移植侵袭模型

2.1.3腹腔内移植侵袭模型

2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模型

2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型

2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型

2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模型

2.1.8视网内界膜侵袭模型

2.2体外癌细胞侵袭模型

2.2.1体外静止器官培养法

2.2.1.1半固体培养基单细胞器官培养法

2.2.1.2液体培养基单细胞器官培养法

2.2.2半体外半体内器官培养法

2.2.3单层细胞器官培养法

2.2.4瘤细胞球体器官培养法

2.2.4.1静止球体器官培养法

2.2.4.2旋转摇动球体器官培养法

2.2.5单层细胞侵袭实验模型

2.2.6Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法。

所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。

第二节Transwell侵袭实验

我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1.实验用品：

①Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。

BD也有已包被好的，价格不清楚。

Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。

linanping1979战友提供的价格：

coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验。

iceyxy战友提供的价格：

Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。

梅林战友提供的BD价格：

240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。

liguofan说国产的boyden30块一个。

jjyy提供的价格是：

corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到。

平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。

不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。

我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。

sword01战友提供的处理方法：

用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。

因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。

以前的ChemiconECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！

很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。

victoh战友对Millipore公司的millicell有比较详细的讲解，链接如下：

本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。

另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。

Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。

maojianwen战友的使用方法：

trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。

再照紫外。

②上层培养液：

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%0.2%BSA。

③细胞：

值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP2的表达。

如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。

另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。

④基质胶：

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等。

CaoY战友的帖这么说的：

Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。

同样的东西在sigma叫ECM。

zhangyong1036战友提供的价格：

BD公司的matrigel1500左右。

如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。

⑤下层培养液：

下层常用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。

⑥细胞培养板：

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。

细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。

但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。

⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。

很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。

如果贴壁不好的话可以试试看。

linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。

另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。

2．步骤

2.1Transwell小室制备

2.1.1无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel1:

8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：

在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel（3.9ug/ul）6080µl（注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2.1.2有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

2.2制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2.3接种细胞

①取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。

24孔板小室一般200µl。

②24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。

这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：

常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。

时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。

我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。

用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。

所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。

时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。

同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。

时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象

在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。

因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

2.4结果统计

检测穿过的细胞数有两种方法：

2.4.1直接计数法

2.4.1.1“贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。

如下图：

通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②染色：

常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。

个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：

（1）.不需要固定细胞，直接染色即可。

（2）.配制简单方便。

（3）.染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映细胞数。

个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。

因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。

使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。

③细胞计数：

我们使用的是LeicaDC300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。

也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。

取若干个视野计数细胞个数。

论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。

我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。

我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。

如图，蓝色部分表示膜的大小，白色圆形表示视野的大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心部分。

这样，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，这样得到结果是比较客观和准确的。

2.4.1.2“非贴壁”细胞计数

由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。

如下图：

2.4.2间接计数法

间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。

2.4.2.1MTT法

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②24孔板中加入500µl含0.5mg/mlMTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃4h后取出。

③24孔板中加入500µlDMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。

取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。

2.4.2.2荧光试剂检测

这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。

Chemicon的ECM554即属于这类。

2.4.2.3结晶紫检测

上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。

但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。

这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数。

第三节Transwell的其他应用的实验步骤

1．Transwell肿瘤细胞迁移实验

过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。

个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。

我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。

另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤

做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：

（1）将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV（Sigma），100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）、无Ca2＋、Mg2＋，无血清的MEM。

（2）用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

（3）离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的LHC8medium（Biofluids）冲洗一次。

（4）冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12mmSNAPWELL,Costar），以37°C5％CO295%空气含5%胎牛血清（GibcoBRL）and100U/ml青霉素and100ug/ml链霉素的LHC8medium孵育6~10天。

（5）孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片

链接：

3.metastasis战友的TranswellB16细胞的体外迁移实验

我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：

首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8um）的下表面涂一层fibronectin（10ug/ml，50ul）,37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，1218小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

链接：

4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁移实验

1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serumfreeMCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6mlserumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜（Olympus,DP50,Japan）.下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。

抑制率计算公式为：

抑制率（%）=[（OD值给药组OD值无刺激阴性对照）/（OD值不加药阳性对照OD值无刺激阴性对照）]×100%.