生物化学10 DNA的复制和修复.docx

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生物化学10DNA的复制和修复

DNA的复制和修复

现代生物学充分证明DNA是生物遗传的主要物质基础。

生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸序列，并通过DNA的复制由秦代传递给子代。

在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成特异地蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。

所谓复制，就是指原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程，

所谓转录，就是在DNA分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程

所谓翻译，就是在RNA的控制下，根据核酸链上的每三个核酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链过程。

在某些情况下RNA也可以是遗传信息的基本携带者，例如，RNA病毒能以自身核酸分子为模板进行复制，致癌RNA病毒还能通过逆转录的方式将遗传信息传递给DNA。

DNA的复制

原核生物每个细胞只含有一个染色体，真核生物每个下拨常含有多个染色体。

在细胞增殖周期的一定阶段整个染色体组都将发生精确的复制，随后以染色体为单位把复制的基因组分配到两个子代细胞中。

染色体DNA的复制和细胞分裂之间存在密切的相互联系。

一旦复制完成，就可发动细胞分裂，细胞分裂结束后，又可开始新一轮DNA复制。

线粒体和叶绿体的DNA可用以编码自身的rRNA和ｔRNA以及一小部分蛋白质，其他的蛋白质则由核基因编码，并在液泡合成后再运进细胞器。

细胞器DNA的复制并不限于核DNA的合成器，而可在整个细胞周期进行。

对于某个DNA分子来说，进入或不进入复制是随机的，因为有些DNA分子在细胞周期中复制不止一次，有些则不发生复制，然而就总体来说，每一细胞周期中细胞器DNA的总量将增加一倍，从而保持了每个细胞的细胞器DNA数量恒定。

由于DNA是遗传信息的载体，在合成DNA时，决定其结构特异性的遗传信息只能来自其本身，因此必须由原来存在的分子为模板来合成新的分子，即进行自我复制。

DNA的双链结构对于维持这类遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。

DNA的半保留复制

DNA由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过氢键连接在一起。

一条链上的核苷酸序列排列顺序决定了另一条链上的排列顺序。

由此可见，DNA分子的每一条链都含有合成它互补链所必需的全部遗传信息。

DNA复制时，母链的两股DNA解开成两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链。

子代细胞的DNA双链，其中一股单链从亲代完整的接受过来，另一股单链则完成重新合成。

两个子代细胞的DNA双链，都和亲代母链的DNA碱基序列一致。

此即DNA的半保留复制。

1958年Meselson和stahl利用氮的同位素

标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。

他们让大肠杆菌在以

作为唯一氮源的培养基中生长，连续生长１２代，从而使所有DNA分子标记上

。

-DNA的密度比普通

-DNA的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，这两种DNA能形成不同的区带。

如果将

标记的大肠杆菌转移到普通培养基中培养（含

的），经过一代后，所有的DNA密度都介于

-DNA和

－DNA之间，即形成DNA分子一半含

，一半含

。

两代后，

和

-

杂合分子等量出现，若再培养，可以看到

-DNA分子增多。

当把

-

杂合分子加热时，它们分开成

链和

链。

这就充分证明了，在DNA复制时原来的DNA分子可被分成两个亚单位，分别构成子代分子的一半，这些亚单位经过许多代复制后仍然保持着完整性。

在这以后，用许多种原核生物和真核生物复制中的DNA做了类似的实验，都证实了DNA复制的半保留方式，然而这类实验所研究的复制中的DNA在提取过程中已被断成了许多片段，得到的信息只涉及DNA复制前和复制后的状态。

１９６３年Cairn用放射自显影的方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA。

他将

脱氧胸苷标记大肠杆菌DNA，然后用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的染色体DNA释放出来，铺在一张透析膜上，在暗处用感光乳胶覆盖于干燥了的表面上放至若干星期。

在这期间

由于放射性衰变释放出

离子，使乳胶曝光生成银粒。

显影后银粒黑点轨迹勾画出DNA分子的形状，黑点数目代表了

在DNA分子中的密度。

把显影后的片子放在光学显微镜下，姐可以观察到大纲杆菌染色体的全貌。

用这种方法，Cairns阐明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留的方式进行复制。

半保留复制，即子代DNA分子中仅保留一条亲代链，另一条链是新合成的，这是双链DNA普遍的复制机制。

即是单链DNA分子，在其复制过程中也通常总是要线形成双链的复制型式（RF）。

半保留复制要求亲代DNA的两条链解开，各自作为模板，通过碱基配对的法则，合成出另一条互补链。

所谓模板即是能提供合成一条互补链所需精确信息的核酸链。

在这里，碱基配对是核酸分子间传递信息的结构基础。

无论是复制、转录或逆转录，在形成双链螺旋分子时都是通过碱基配对来完成的，需要指出的是，碱基、核苷或核苷酸单体之间并不形成碱基对，但是在形成双链螺旋时由于空间结构的关系而构成特殊的碱基对。

DNA的半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性，经过许多代的复制，DNA的多核苷酸链仍可保持完整，并存在于后代而不被分解掉。

DNA与细胞其他成分相比要稳定得多，这和它的遗传功能是相符的。

但是这种稳定是相对的，DNA在代谢上并不是完全惰性的物质。

在细胞内外各种物理、化学和生物因子的作用下，DNA会发生损伤，需要修复；在复制和转录过程中DNA也会有损耗，而必须进行更新。

在发育和分化过程中，DNA的特定序列还可能进行修饰、删除、扩增和重排。

DNA复制的起点和终点

基因组能独立进行复制的单位叫做复制子。

每个复制子都含有控制复制起始地起点（

），可能还有终止复制的终点。

复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，它将继续下，直到整个复制子完成复制。

原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子。

实验表明，它们都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多是双向的，即形成两个复制叉或生长点，分别向两侧进行复制；也有一些单向的，只形成一个复制叉或生长点。

通常复制是对称的，两条链同时进行复制。

DNA在复制叉处两条链解开，各自合成其互补链，在电子显微镜下可以看到形如眼的结构，环状DNA的复制眼形成希腊字母

形结构。

真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子。

通过放射自显影的实验可判断DNA复制是双向进行的，还是单项进行的。

在复制开始时，先用低放射性的

-脱氧胸苷标记大肠杆菌，经数分钟中后，再转移到含有高放射性的

-脱氧胸苷培养基中继续进行标记。

这样在放射自显图像上，复制器起始区的放射性标记密度较低，感光还原的银颗粒密度就较低；继续合成区标记大肠杆菌放射性标记密度较高，感光还原的银颗粒密度就较高。

若是单向复制，银颗分布密度应是一端低，一端高。

若是双向复制，则应是中间密度低，两端密度高。

由大肠杆菌所获得的放射自显图像都是两端密，中间疏，这就清楚证明了大肠杆菌染色体DNA是双向修复的。

大多数生物染色体DNA的复制是双向的，并且是对称的，然而也有例外。

枯草杆菌染色体DNA的复制虽是双向，但是两个复制叉移动的距离不同。

一个复制叉仅在染色体上移动五分之一距离，然后停下等待另一复制叉完成五分之四距离。

质粒R6K的两个复制叉的移动也是不对称的。

有一种单向的特殊复制方式，称为滚动环。

噬菌体

是环状单分子，它在复制过程中首先形成共价闭环的双联分子（复制型）,然后其正链由A蛋白在特定位置切开，游离出一个3’末端，A蛋白连在5’末端。

随后在DNA聚合酶催化下，以环状负链为模板，从正链的３’－OH末端加入脱氧核苷酸，使链不断延长，通过滚动合成出新的正链。

合成一圈后，露出切口顺序，A蛋白再次将其切开，并连在切出的5’磷酸基末端，游离出单位噬菌体环状单分子DAN。

实验证明某些双链的DNA和合成也可以通过滚动环的方式进行。

例如噬菌体

复制的后期。

另一种单向复制的特殊方式称为取代环或D－环式。

线粒体的DNA复制方式采取这种方式（纤毛虫的线粒体DNA为线型分子，复制方式与此不同）。

双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代。

真核生物染色体DNA的复制要比原核生物慢得多，这是由于真核生物的染色体具有复杂的高级结构，复制时需要解开核小体，复制后又需重新合成核小体。

综上染色体的复制方式有：

1.直线双向复制：

单点双向（T7）

2.多起点双向：

真核染色体DNA

3.滚环复制：

环状单链DNA，

4.Ｄ型复制：

线粒体、叶绿体DNA

5.多复制叉复制：

第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。

在大肠杆菌营养丰富时，可采取多复制叉复制方式。

DNA反应聚合有关的酶

DNA由脱氧核糖核苷酸聚合而成。

与DNA稽核反应有关的酶包括多种DNA聚合酶和DNA连接酶。

DNA聚合酶

１９５６年Kornberg首先从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶。

其后从广泛不同的生物中都找到这种酶。

有适量DNA和镁离子存在时，该酶能催化四种脱氧核糖核酸三磷酸合成DNA，所合成的DNA具有与天然DNA相同的化学结构和物理性质。

ｄATP、dGTP、dCTP和dTTP四种脱氧核糖核苷酸三磷酸缺一不可；它们不能被相应的二磷酸或一磷酸化合物所取代，也不能被核糖核苷酸所取代。

在DNA聚合酶催化下，脱氧核糖核苷酸被加到DNA链的末端，同时释放出无极磷酸。

DNA聚合酶催化的链延长反应中，链的３’羟基对进入的脱氧核糖核苷三磷酸的

磷原子发生亲核供给，从而形成３’５’磷酸二酯键并脱下焦磷酸。

形成磷酸二酯键所需要的能量来自

－与

－磷酸基之间高能磷酸键的裂合，聚合反应是可逆的，但随后的焦磷酸水解可推动反应的完成。

DNA由５’段向３’端方向延长。

DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核酸自身发生聚合，它需要引物链的存在，加入的核苷酸则由模板链所决定。

与生物小分子的合成不同，信息大分子的合成除了需要有底物、能量和酶外，还需要模板。

DNA聚合酶催化的反应是按模板的指令进行的，只有当进入的碱基能与模板链的碱基形成Watson－Crick类型的碱基对时，才能在该酶催化下形成磷酸二脂键。

因此，DNA聚合酶是一种模板指导的酶。

加入各种不同生物来源的DNA做模板，可以同样引起和促进新的DNA的酶促合成，而产物DNA的性质完全不取决于聚合酶的来源，也与四种核苷酸前体的相对比例无关，而仅仅取决于所加入的模板DNA。

产物DNA作为模板的双螺旋DNA具有相同的碱基组成，这说明在DNA聚合酶的作用下，模板DNA和两条链都能进行复制。

DNA聚合酶的反应可以利用双链DNA作为模板和引物，可以了利用单链DNA作为模板和引物。

在单链DNA的复制中，３－羟基末端通过链的自身回折成为引物链，其余未配对的链则为模板链，由此形成发夹环结构。

双链DNA的复制发生在切口、缺口或末端单链区。

　　综上所述，DNA聚合酶的反应特点为：

１。

以四种脱氧核糖核苷三磷酸作为底物２.反应需要接受模板的指导３.反应需要有引物３’羟基的存在　４.DNA链的生长方向为5’-3’5.产物DNA性质与模板相同，这就表明了DNA聚合酶合成的产物是模板的复制物。

各种不同类型的DNA聚合酶

大肠杆菌中共含有五种不同的DNA聚合酶，分别成为l、ll、lll、lV、V

DNA聚合酶l

反应时需要有引物链（DNA链或RNA链）是一个多功能酶，可以催化以下反应。

1.通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿着5’方向到3’方向延长（DNA聚合酶活性）

2.由３’水解DNA链（３’→５’核酸外切酶活性）

3.由５’水解DNA链（５’→３’核酸外切酶活性）

4.由３’端发生焦磷酸解

5.无极焦磷酸盐与脱氧核糖核苷酸之间的焦磷酸基交换

焦磷酸解释聚合反应的逆反应，焦磷酸交换反应则是由前两个反应连续重复多次引起的。

实际上DNA聚合酶l兼具３’→５’核酸外切酶活性以及５’→３’核酸外切酶活性

DNA聚合酶被酶蛋白切开的大片段称为Klenow片段，呈右手结构，右手结构是核酸聚合酶的共同特征。

模板核酸落入核酸聚合酶拇指结构和指形结的凹槽时，引起构象改变，从而使聚合酶能够握住核酸分子。

聚合酶之所以能够辨认进入的底物核苷酸，因为凹槽空间只允许底物与模板之间形成符合配对原则的碱基配对。

非配对碱基因空间位置不合适而不能进行聚合反应，这就保证了新合成的链严格按照模板的互补碱基顺序进行聚合，在这里，酶对底物进行了专一的核对，然而错配的碱基仍然不可避免的会出现。

DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性能切除单链DNA的３’末端核苷酸，而对双链DNA不起作用，故不能形成碱基对的错配核苷酸可被酶水解下来。

然而在正常聚合条件下，3’-5’核酸外切酶活性不能作用于生长链；若一旦出现错配碱基对，聚合反应即停止，生长链的３’末端核苷酸落入３’→５’外切酶位点，错配核苷酸迅速被除去，然后聚合反应才得以继续进行下去。

3’-5’核酸外切酶活性被认为起着校对的功能，它能纠正聚合过程中的碱基错配。

由此可见，DNA复制过程中碱基配对要受到双重核对：

一是聚合酶的选择作用，二是3’-5’核酸外切酶的校对作用。

有了3’-5’核酸外切酶校对，大大降低了错误率。

3’-5’核酸外切酶的校对作用对DNA复制的忠实性极为重要。

如果没有这种活性，DNA复制的错误将大大增加，例如T4噬菌体突变率很高，从这种变异株得到的T4DNA聚合酶中3’-5’外切酶活性很弱，在DNA复制中非常容易出错误，起着促突变因子的作用。

（相对的，就起到抗突变因子的作用）

所以3’-5’核酸外切酶活性对聚合酶的比值与DNA复制的准确性有关，进而影响到自然突变率。

抗突变菌株的DNA聚合酶虽然是高度保真的，但在进化中未必优越，因为一定的自然突变率队生物的进化是必要的，若外切酶活性较强，甚至在聚合条件下失去对外切酶的抑制作用，造成正常聚合的核苷酸不断被切除，这是个耗能大，效率低的系统。

DNA聚合酶ｌ尚有５’－３’外切酶活性，它只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5’末端水解下核苷酸或寡核苷酸。

因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起重要作用。

DNA半不连续合成中冈崎片段５’端RNA引物的切除也有赖于这个外切酶。

DNA聚合酶ｌｌ

聚合酶ｌ合成DNA的速度太慢，只及细胞DNA复制速度的百分之一。

其次，其持续合成能力较低，细胞内DNA合成的复制不会频繁中断，另外遗传学分析表明许多基因突变都会影响DNA的复制，但和聚合酶l无关。

通过对缺乏聚合酶l的变异菌株发现其DNA复制正常，但是损伤的修复机制有明显的缺陷。

由此直接表明，DNA聚合酶l不是复制酶，而是修复酶。

后来证明，在DNA复制过程中起着取代RNA引物的作用，只是参与局部修复。

聚合酶ｌｌ为多亚基酶，酶活力比聚合酶ｌ高，也是由四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物，从５’－３’方向合成DNA，并需要有缺口的双链DNA作为模板一引物，但缺口不能太大否则酶活力将降低。

反应需要镁离子和氨根离子激活。

聚合酶ｌｌ具有３’－５’核酸外切酶活性，但是无５’-３’核酸外切酶活性。

聚合酶ｌｌ也不是复制酶，而是一种修复酶。

聚合酶ｌｌｌ

聚合酶ｌｌｌ也是由多个亚基组成的蛋白质，现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责从新和成的DNA的复制酶。

虽然每个大肠杆菌细胞中只有１０－２０个聚合酶ｌｌｌ分子，然而它催化的合成速度达到了体内ＤＮＡ合成的速度。

聚合酶ll与lll基本性能是相同的：

1.都需要模板的指导，以四种脱氧核糖核苷三磷酸作为底物，并且需要有3’-OH引物链存在，聚合反应按5’-3’方向进行2.他们都没有5’-3’外切酶活性，但都有3’-5’核酸外切酶活性，在聚合过程中起校对作用3.它们都是多亚基酶，DNA聚合酶ll和lll共用了许多辅助亚基。

聚合酶ll和聚合酶lll与聚合酶l相比有明显的区别：

聚合酶ll和聚合酶lll最宜作用于带有小段缺口的双链DNA；而DNA聚合酶l最宜作用于具有大段单链区的双链DNA，甚至是带有很短引物的单链DNA。

它们的聚合速度、持续合成能力均有很大不同，反映了它们功能的不同。

聚合酶ｌV和Ｖ

　　这两种酶涉及DNA的错误倾向修复。

当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，但修复缺乏准确性，因而出现高突变率。

DNA链接酶

DNA聚合酶只能催化多核苷酸链的延长反应，不能使链之间连接。

环状DNA的复制表明，必定存在一种酶，能催化链的两个末端之间形成共价连接。

即DNA链接酶，其能催化双链DNA切口处的5’磷酸基和3’羟基生成磷酸二脂键。

连接反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以腺胺三磷酸（ATP）作为能量来源

大肠杆菌DNA链接酶要求断开的两条链由互补链将它们聚在一起，形成双螺旋结构。

它不能将两条游离的DNA分子连接起来。

DNA的半不连续复制

在体内，DNA的两条链都能作为模板合成出两条新的互补链。

但是由于DNA分子的两条链是反向的。

DNA聚合酶的合成方向都是5’-3’，这就很难说明DNA在复制时两条链如何作为模板合成其互补链。

所以日本学者冈崎提出了DNA的半不连续复制模型。

认为3’-5’走向的DNA实际上是由许多5‘-3’方向合成的DNA片段连接起来的。

冈崎用

-脱氧胸苷标记噬菌体T4感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度离心法分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子，最初出现的DNA片段长度约为1000个核苷酸左右，一般称为冈崎片段。

用DNA连接酶变异的温度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量DNA片段积累。

这说明在DNA复制过程中首先合成较短的片段，然后由DNA连接酶连成大分子。

这也就是不连续合成。

DNA的不连续合成不只局限于细菌，真核生物染色体的DNA复制也是如此。

不过冈崎的实验并不能判断DNA链的不连续合成只发生在一条链上，还是两条链都如此，对冈崎片段进行测定，其数量远远超过新合成的DNA的一般，似乎两条链都是不连续的。

后来发现这是由于尿嘧啶代替胸腺嘧啶掺入DNA所造成的。

DNA中的尿嘧啶可被尿嘧啶－DNA-糖苷酶切除，随后该处的磷酸二脂键断裂，一些核苷酸被水解，造成一个缺口，最后缺口空袭被填补和修复，在此过程中也会产生一些类似冈崎片段的DNA片段。

用缺乏糖苷酶的变异菌株进行实验，DNA的尿嘧啶将不再被切除，此时新合成的DNA大约有一半放射性标记出现于冈崎片段中，另一半直接进入大的片段。

由此可见，DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，此即半不连续复制。

以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是３’→５’走向，在其上DNA能以５’－３’方向连续合成，成为前导链；另一条模板链是５’－３’走向，但是在其DNA上也是从5’-3’合成，但是与复制叉的移动方向是相反，随着复制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后练成一条完整的DNA链，该链称为滞后链。

由于DNA复制酶系不易从DNA模板上解离下来，因此前导链的合成通常是连续的。

但是有很多因素会影响前导链的连续性，例如模板链的损伤、复制因子和底物供应不足，都会引

起前导链复制中断并从另一新起点开始。

RNA引物

DNA聚合酶不能发动新链的合成，只能催化已有的链的延长反应。

RNA聚合酶则不同，它只需要DNA模板存在，就可以在其上合成出新的RNA链。

所以DNA合成需要引物，RNA合成不需要引物。

冈崎片段是新合成的链，它是如何开始的，引物又是什么?

现在知道DNA模板上需要先合成一段RNA引物，DNA聚合酶从RNA引物的３’－OH端开始合成新的DNA链。

冈崎片段的合成除了需要四种脱氧核糖核苷酸外，还需要四种核糖核苷酸。

新合成的DNA片段上共价连接着一段小RNA链。

专一的水解酶证明，RNA链位于DNA片段的５’末端。

RNA引物是在DNA模板链的一定部位合成并互补于DNA链，合成方向是5’-3’，催化该酶的反应是引物合成酶（该酶作用时酶与另外６种蛋白质结合形成引发体）。

引物的长度通常为几个核苷酸至十多个核苷酸，DNA聚合酶ｌｌｌ可在其上聚合脱氧核糖核苷酸，直至冈崎片段的合成。

RNA引物的消除和缺口的填补是由DNA聚合酶ｌ来完成的，最后由DNA连接酶将冈崎片段练成长链。

生物体之所以要用如此复杂的机制去复制DNA，主要是为了保持DNA复制的高度忠实性，生物体的自发突变都是由DNA复制时碱基对的错配引起的。

DNA聚合酶对底物的选择作

用以及３’－５’外切酶的校对作用使错配概率大大降低，在体内结构下，其复制的复杂结构进一步提高了复制的准确性；修复系统可以检查出错配碱基和DNA各种损伤并加以修复。

DNA聚合酶之所以要有引物的存在即不能从无到有合成新的链是因为在未核实前一个核苷酸处于正确配对状态，是不会进行聚合反应的。

RNA聚合酶没有校对功能，因此不需要引物，RNA引物都是从新开始合成的，它的错配可能性大，在完成引物作用后DNA聚合酶ｌ将其删除，而代之以高保真的DNA链。

DNA复制的拓扑性质（未整理，P419）

DNA的复制过程

DNA复制过程可分为三个阶段：

起始、延伸和终止。

其间的反应和参与作用的酶和辅助因子各有不同。

在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称复制体。

DNA复制的阶段表现在其复制体结构的变化。

复制的起始

大肠杆菌复制的起点称为

，由245个bp（碱基对）构成，其序列和控制元件在细菌复制点中十分保守。

关键序列在于两组段的重复：

三个13bp的序列和四个9bp序列（DnaA蛋白结合位点）。

正如上面所说大肠杆菌起点复制包括多种酶和辅助因子。

Dna蛋白各带一个ATP结合在此位点上，并聚集在一起，DNA缠绕其上，形成起始复合物。

ＨU蛋白可与DNA结合，促使双链DNA弯曲。

DanB借助水解ATP产生的能量，沿着DNA链５’－３’方向移动，解开DNA的双链，此时称为前引发复合物。

DNA双链的解开还需要DNA旋转酶（拓扑异构酶ll）和单链结合蛋白（SSB），前者可以消除解螺旋酶产生的拓扑张力，后者保护单链并防止恢复双链。

至此引物合成酶合成RNA引物，并开始DNA的复制。

复制的起始要求DNA呈负超螺旋，并且起点附近的基因处于转录状态，这是因为DnaA只能与负超螺旋的DNA相结合。

RNA聚合酶对复制起始的作用，可能是因其在起点邻近处合成一段RNA，形成RNA突环，影响起点的结构，因而有利于DnaA的作用。

DNA复制的调节发生在起始阶段，一旦开始复制，如无意外受阻，就能一直进行到完成。

DNA复制的发动与DNA甲基化以及细菌质膜的相互作用有关。

Dam甲基化酶可以使起始序列中的腺嘌呤的第六位Ｎ甲基化。

DNA完成复制后，大肠杆菌的亲代链依然保持着甲基化，而新合成的链未甲基化，因此是半甲基化的DNA。

半甲基化的起点不能发生复制的起始，直到Dam甲基化酶使起点完全甲基化。

甲基化的延迟可能是因为

与膜结合而阻碍了Dam甲基化酶的作用。

复制的延伸

复制的延伸阶段同时进行前导链和滞后链的合成。

这两条链合成的基本反映相同，并且都由DNA聚合酶ｌｌｌ催化。

但两条链的合成也有明显差别

前者持续合成，后者分段合成。

因此参与的蛋白质因子也有不同

亲代DNA首先必须由DNA解旋酶将双链解开，其产生的拓扑异构张力由拓扑异构酶释放，分开的链被单链结合蛋白所稳定。

自此之后，前导链与滞后链的合成便有所不同

复制起点解开后形成两个复制叉，既可进行双向复制。

前导链开始合成后通常都一直继续下去。

先由引物合成酶（DnaG蛋白）在起点处合成一段RNA引物，前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一些，