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分子生物学课堂笔记
分子生物学
真核生物的基因
1.真核生物基因组的一般特点
真核生物的基因组一般比较庞大，远大于原核生物的基因组。
真核生物的DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内。
真核基因组存在着许多重复序列，重复次数可达几百万以上。
绝大多数真核生物编码蛋白质的基因为断裂基因，即结构基因是不连续排列的，中
间由插入序列隔开。
真核生物基因组中不编码的区域多于编码区域。
真核生物不仅含有核内染色体DNA，还有核外细胞器DNA、核外细胞器有线立体DNA和叶绿体DNA。
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2.断裂基因（不连续基因）interruptedordiscontinuousgenes
SV40A蛋白基因含有一段346NT的间隔区。
每个活性珠蛋白基因含有两个间隔区。
卵清蛋白基因含有7个插入序列被分成八段。
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3.基因家族与基因簇genefamily&genecluster
定义：
真核生物基因组中许多来源相同，结构相似，功能相关的基因在染色体上成
串存在，这样的一组基因称为基因家族。
多基因家族是真核生物基因组织的一个重要特征。
多基因家族在基因组中的分布情况不同，有些基因成串排列集中在一条染色体上，
集中成簇的一组基因形成基因簇。
也称串联重复基因（见后）。
如组蛋白基因,rRNA基因,tRNA基因等。
而有些基因家族成员不集中排列，而是分散在基因组的不同部位。
如干扰素，珠蛋白，生长激素，SOX基因家族。
在多基因家族中，有些成员不具有任何功能，这类基因叫假基因（pseudogene）。
4.串联重复基因`
特征：
A.各成员间有高度的序列一致性或完全相同。
B.拷贝数高，几十个至几百个。
因其在细胞中的需要量很大。
C.非转录的间隔区短而一致。
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组蛋白基因
五种组蛋白基因彼此靠近构成一个重复单位。
许多这样的重复单位串联在一起，构
成组蛋白基因簇。
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rRNA基因
原核生物有三种rRNA：
5S，16S，23S
真核生物有四种rRNA：
5.8S,18S,28S,5S
主体rRNA：
三种主体rRNA基因组成重复单位，转录出一个45SrRNA，经转录后处理切除间隔区成为18S，5.8S，28S三种rRNA。
核仁：
核中rRNA基因大量地转录成RNA，由于其染色性质与DNA不同，在光学显微镜下形成特殊的区域，这一结构，称为核仁（nucleole）。
含有rDNA串联重复单位的染色体称为核仁组织者（nucleoolarorganizers）。
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tRNA基因
tRNA长约70-80bp，其基因约长140bp。
TRNA也是串联重复排列，但个重复单位中各个tRNA基因可以相同可以不相同。
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5.细胞器基因
真核生物细胞器中有两类细胞器能够携带遗传物质。
动物生殖细胞中只有卵子才有线立体基因，而精子缺乏。
线立体DNA多为环状非重复DNA序列。
属于核外DNA。
线粒体和叶绿体均编码自身所需的某些蛋白质以及tRNA和rRNA，其余均由核基因编码。
细胞器有自己的蛋白质合成器。
只有两种rRNA。
哺乳为12S和16S，酵母为18S和21S（含有一内含子）。
tRNA比核内编码的tRNA小。
酵母DNA为84kb。
其上面的基因有三个特点。
哺乳动物线立体DNA不同于酵母。
人体线立体基因排列非常紧密。
人类线立体DNA为16.569kb。
含37个基因；13个蛋白质基因；1个cytb基因；2个ATP酶亚基基因；3个CO亚基基因（细胞色素氧化酶亚基）；7个NADH脱氢酶亚基基因；2个rRNA基因：
12SrRNA、16SrRNA；22个tRNA基因。
3.4真核生物的染色体
真核生物DNA复性动力学
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真核生物染色体上的单一序列和重复序列以及卫星DNA
单一序列又称非重复序列
轻度重复序列
中度重复序列
高度重复序列
卫星DNA的等级结构及其起源和进化
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染色质和核小体染色质核小体着丝粒端粒
DNA复制、转录与翻译
4.1DNA复制
一.DNA的半保留复制
Watson&Crick最早提出DNA的半保留复制机制。
即是：
DNA分子的双螺旋在复制时分开，各自作为新链合成时的模板，复制后，每一个新的双链DNA分子都是由一条亲链和一条新合成的子链组成的。
合成过程中亲链和子链间严格的碱基配对是DNA复制的基础。
图示DNA复制（Meselson-Stahl实验——Cscl超离心显示不同比重DNA带）
二.复制原点，方向和方式或DNA复制是从特定的位点开始并按特定的方向进行
实验证明，DNA分子复制时不是随机起始的，而是从特定的位点开始的，这一特定的位点叫做复制起始点或复制原点，常用ori或o表示。
许多生物的复制点都是DNA呼吸作用强烈的区段，即是经常开放的区段（frequentlyopeningregion）亦即富含A，T的区段。
这一区段产生瞬时单链与SSB蛋白（single-strandedDNAbindingprotein）结合，对复制的起始十分重要。
复制从特定的位置开始，大多数双向进行，也有一些单向的或以不对称的双向方式进行。
在复制原点双链DNA解旋形成复制叉。
在复制叉处，新合成的子链DNA以各自的亲链为模板，总是从5'-3'方向合成。
复制叉是不对称的，即两条新合成的链中，一条链是连续合成，叫前导链（leadingstrand），另一条链是在模板DNA指导下，通过一个叫DNA引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约10个NT的RNA引物为DNA聚合酶提供3‘——OH，然后合成一个称之为冈崎片段的不连续的DNA片段，再经专门的DNA修复系统，去除RNA引物，再经DNA连接酶通过磷酸二酯键将其连起来，完成该子链的合成，这一条链叫后随链（laggingstrand）
。
依据DNA合成的起始方式，复制分为两种类型：
复制叉式（包括复制）和滚环式复制又叫复制。
三.DNA复制的酶学
是一个复杂的酶学过程，需要30多种酶而后蛋白质的参与，构成复制体（replisome）
1.DNA聚合酶及其聚合反应
DNAPOL是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成DNA的一类酶，其催化反应为：
DNApol.DNA-OH——————》DNA-（pdN）n+nppidNTPMg2+
这一原理被应用于现代技术中如PCR中的Tag酶作用机理。
所有真核生物和原核生物都有几种DNA聚合酶，这些聚合酶协同作用负责染色体DNA的复制，DNA分子的修复，核DNA的重组以及染色体外DNA的复制。
原核生物有三种DNA聚合酶，即PolI，PolII，PolIII，PolIII是DNA复制的主酶。
真核生物有五种DNA聚合酶，即，，，，。
，，是复制主酶，是核DNA复制的重要酶。
2.脱氧核苷三磷酸前体的来源
有两个来源：
废物利用——体内核酸降解或直接来自培养基
新合成途径——利用生物体的氨基酸，CO2，NH3和磷酸核糖焦磷酸合成核
糖核苷单磷酸（NMP）
核苷单磷酸激酶
NMP+ATP——————————NDP+ADP
核糖核苷酸还原酶
NDP——————————dNDP
脱掉核糖2‘上的氧
核苷二磷酸激酶
dNDP+ATP——————————dNTP+ADP（dNTP：
四种脱氧核糖核苷酸）
所有生物的核酸链的合成都是按5‘——》3‘方向进行的，无一例外。
3.三种DNA聚合酶的结构和功能
4.DNA连接酶
DNAPol虽能填充缺口，但不能使缺口接合，而连接酶则能完成接合任务。
5.与DNA几何性质有关的酶
螺旋酶（helicases）又称解旋酶，使双链DNA分离:
C.螺旋酶I，II，与产物单链DNA结合
F.螺旋酶III，催化双链DNA分离，与SSDNA结合蛋白质配合。
DNA旋转酶（Eco拓扑异构酶II）
多数天然DNA具有负超螺旋，可变为泡状单链形式，利于蛋白质结合，并可缓解复制叉前移造成的抄缠现象，但当5%的环行DNA双链已经复制时，原有的负超螺旋已被用尽，若复制叉再前移，就产生拓扑学问题，就需要拓扑异构酶来解决。
在Ecoli中，主要是DNA旋转酶（Eco拓扑异构酶II），他能产生负超螺旋并消除复制叉前移产生的正超螺旋。
所以，如果加入几种DNA螺旋酶的抑制剂，如香豆霉素，新生霉素，萘啶酮酸等均能抑制细菌DNA的复制，P94图示复制叉前移的拓扑学问题。
DNA复制的半不连续性
1.半不连续性复制的发现
2.引物和引发酶
DNA复制过程中，复制叉是不对称的。
两条新合成的链中，一条是连续合成的，叫前导链
；另一条是在模板DNA指导下，通过一种叫DNA引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约10个核苷酸组成的RNA引物（RNAprimer）为DNA聚合酶提供3’-OH，然后合成称为冈崎片段的不连续的DNA片段，最后由DNA修复系统去除RNA引物而代之以DNA，再由DNA连接酶通过3‘5’-磷酸二酯键将其连接起来，完成此子链的合成，这条子链叫后随链。
由于DNA聚合酶在没有引物情况下不能从头合成DNA，必须有一条引物。
研究发现的引物大多数为一段RNA，长度和序列随基因组的种类而异，为1-10个核苷酸见表3P98。
该引物RNA与经典的RNA（mRNA）不同，，他们合成后不与模板分离，而是以氢键与模板结合。
他可能由一种独特的RNA聚合酶所合成，这种合成RNA引物的酶旧叫引发酶。
那么，前导链是如何合成的？
三种可能性：
1）同后随链一样，由RNA引物提供3‘-OH；
2）可能模板上的起始点产生缺口，暴露3’-OH作引物；3）可能由后随链提供3‘-OH。
3.前体片段的连接
真核生物的DNA复制
1真核生物的复制原点，复制元和复制元族
真核生物的DNA聚合酶活性比大肠杆菌低得多，复制速度为500bp-5000bp/分（Ecoli为105bp/分）如按哺乳动物的DNA比细菌大约50倍，真核生物DNA复制时间就会是大肠杆菌的1000倍，即约一个月，而事实上，真核生物DNA复制时间一般为几小时，这是因为通过从许多原点同时开始并双向复制而实现的。
放射形自显影可见许多的复制泡。
每一复制泡有固定的一点（复制原点），然后双向伸展，与相酃的复制泡会合。
这样一段DNA称为复制单元，简称复制元（replicon）。
而几个复制元可组成复制元族，同一族内的复制元基本同步。
真核生物复制原点的DNA序列并无固定的模式，但大多包含一个富含AT的序列，可能还有一个特异性蛋白质的结合位点。
2真核生物的DNApol和引发酶primase
与真核生物多起点复制相适应的是，细胞中DNA聚合酶的分子数目多，在Ecoli中，POLIII只有10-20个分子，而哺乳动物细胞中DNAPOL有2000-60000个分子，DNAPOL与DNA引发酶结合很紧，是复制体系必需的复合物。
实验表明，在细胞DNA合成期（S期），DNAPOL含量剧增。
协同的作用，负责线立体DNA的复制，含量变化不大，与损伤DNA修复有关。
引发酶的作用：
B.是与引发酶复合物所必需的
E.其引物合成方式特别，阵发性合成，
F.可利用rNTP和dNTP为合成前体。
引物一般为6-15个NT。
1SV40以及其他真核生物的DNA复制过程
SV40所编码的蛋白质中，只有一个大T抗原参与其DNA复制，其余复制机制由寄主的蛋白质构成。
大T抗原四聚体在复制原点有三个结合位点，同时还具有ATPase活性和螺旋酶活性。
SV40的DNA复制有可能代表真核生物的DNA复制的主要过程：
首先由一特异的蛋白质识别复制原点并与之结合。
——》再由螺旋酶促进负超螺旋状的复制原点解链——》单链DNA结合蛋白质（SSB）维持解链区并以动态左右前移——》在由POL和引发酶与原点上的特异蛋白质相互作用，从而引发复制叉的先导链的合成；然后再印发另一先导链的合成——》随着复制叉的前进，需要拓扑异构酶解除复制叉前进造成的超缠现象。
当相酃的两个复制元的相向的两个复制叉结合时就完成了这一段DNA的复制，可能并不存在固定的终止序列。
而真核生物染色体末端DNA的复制却不那么简单。
见后。
2真核生物染色体末端DNA的复制
由于RNA引物的水解，两个子代分子中各有一个5‘端缺少一段核苷酸，而没有一个目前已知的DNAPOL能填补。
腺病毒DNA的5‘末端共价连接一个55kD的蛋白质，即末端蛋白质（TerminalProteinTP）,而正在复制的腺病毒新生的DNA5‘端为80kD的蛋白质，为末端蛋白质前体（pTP），这一引发方式避免了线性DNA在复制结束后的5’末端隐缩问题。
真核生物同样面临线性DNA复制结束时产生的5‘末端隐缩问题。
这个问题的解决取决于端粒的结构和能够识别和结合端粒的蛋白和酶。
四膜虫端粒中有一种端粒酶（）能将其端粒结构中单链尾巴5‘TTGGGG3’延长，延长的部分仍是5‘TTGGGG3’，这一富含G的序列总是突出12-16个NT。
这种酶是一种核糖核蛋白，由RNA和蛋白质组成。
有人证明该酶中的RNA是富含G序列的模板，对拷贝出富含G序列所必需的部分为5‘CAAAACCCCAAAA3’，此RNA可能还有其他作用，这单链尾巴可能弯转成为引物复制5‘末端，另一可能是某种端粒蛋白结合末端的单链重复序列，并作为蛋白质引物复制DNA地’末端。
复制的调控
DNA复制是受调控的，细胞分裂时间因营养条件变化很大（21-70分钟/Ecoli），而DNA复制时间为40分钟左右，可用成熟前起始加以解释细胞分裂时间为21分钟的DNA复制。
DNA复制调控，可能涉及许多专一性的蛋白因子（EcoliDnaA,SV40大T抗原等）和至少一类RNA分子（RNA2，RNA1）。
细胞中蛋白质和DNA总量的比例也可能是一重要因素，因为氨基酸饥饿时会抑制蛋白质合成和DNA复制起始。
在此说明一下RNA2和RNA1：
大肠杆菌质粒ColE1的复制需要一种RNA引物，RNAPOL从复制原点上游方向555bp处转录，这个转录物就是RNA2。
RNA2延伸至复制原点区域时，由RNAaseH将RNA与DNA模板形成的杂合双链中的RNA切断，从而产生3’-OH末端，然后，DNAPOL以此引物合成DNA。
图示P130。
在ColE1复制原点上游方向445bp处（相当于RNA2的第111个碱基位置），起始转录另一个RNA分子，即是RNA1，其转录方向与RNA2相反。
这个反义的RNA1有111个碱基与RNA2的5’末端互补，从而改变了RNA2的二级结构使之不能为RNAaseH（识别杂交双链但不识别二级结构）所识别，于是，RNA2的转录能够继续进行，而不能在复制原点区域RNA。
有些机理有待继续探讨。
4.2转录
一概述
三类RNA都必须以DNA模板，在依赖于DNA的RNAPOL作用下合成，他包括RNA链的起始，延
伸，终止等步骤，这一系列过程叫转录。
转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。
转录涉及两个方面
一是RNA合成的酶学过程
二是RNA合成的起始信号和终止，即DNA上的特定序列。
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DNA和RNA的碱基序列方向总是5'-3'。
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阐述几个概念：
对DNA总是讲模板链，在转录时DNA两条链有混乱不一。
新文献规定：
把不作模板转录的链称为有义链（sense）又称编码链（coding）,非模板链=RNA链=有义链而把作为模板转录的链称反义链（antisensestrand）或模板链,模板=反义链。
对RNA，也容易将DNA序列直接与氨基酸的密码子联系起来：
SSDNAphage如ΦX174，其SSDNA作为复制模板进入细胞后复制合成互补DNA，后者（互补DNA）作为转录模板（即反义链）合成RNA。
即SSDNA=有义链=RNA序列=正链对于SSRNA病毒，若其基因组RNA能作为mRNA或与mRNA相同，则该RNA病毒为正链RNA病毒；若其RNA进入宿主需要进行RNA复制，再产生互补链作为mRNA，则这种RNA称为负链RNA病毒。
二RNA合成的酶学
1.RNA合成的基本特征
1）RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸（rNTP）：
ATP，GTP，CTP，UTP
2）RNA链的生长方向也是5’—3’
3）核苷三磷加到新生链的3'，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键。
4）转录必须以一条DNA链为模板，按碱基互补进行转录。
5）RNAPOL能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸（XTP）RNA合成含四步：
RNAPOL结合于DNA上的特定位点，起始，链的延长，链终止和释放。
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2.EColi和真核生物的RNAPOL（自己看）`
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三控制转录起始的DNA序列——操作子和启动子结构
1.操纵元（operon）及其结构
操纵元：
包括结构基因和控制区以及调节基因的整个核苷酸序列。
控制区为两部分：
1）从结构基因溯流而上的紧靠结构基因的部分叫操作子（operator）（即结构基因的5’上游），好比电器开关，控制其后面的全部结构基因的开闭。
2）从操作子逆行而上的就是另一控制区域，叫启动子（promoter）对转录非常重要。
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2.原核生物的启动子
1）Pribnow框：
—10bp处，是RNAPOL结合位点
2）Sextama框：
—35bp处，RNApol先结合与此处，再结合于—10bp处。
3）CAP位点：
CAP为环腺苷酸受体蛋白（cyclicAMPreceptor）。
调节基因产生的阻遏蛋白与操纵子以及诱导物互作实现对基因转录的负调控；而葡萄糖的调控机理则为正调控。
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3.真核生物的启动子
真核生物有三种RNAPOL：
POLI：
负责转录rRNA，只有一种启动子。
POLII：
负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，启动子最复杂。
POLIII：
负责转录tRNA和5SrRNA，启动子位于转录的DNA序列内（内部启动子）。
1）RNAPOLI的启动子
2）RNAPOLII的启动子结构
A.帽子位点
B.TATA框：
C.CAAT框
D.增强子
3）RNAPOLIII的下游启动子
第五章基因工程
5.1基因工程的四大要素及其实施要点
1.工具酶
1）限制性内切酶
2）连接酶
3）修饰酶
4）DNA聚合酶：
A.DNA聚合酶I；
B.Klenowfragment
C.T4orT7DNApolymerase
D.TaqDNApolymerase
E.RT:
依赖RNA的DNApolymerase
5）依赖于DNA的RNA聚合酶
6）T4噬菌体多核苷酸激酶TK：
磷酸化
7）碱性磷酸酶:
脱磷酸
细菌碱性磷酸酶（B.AlkalinePhosphatase）
小牛肠碱性磷酸酶（CalfintestinalPhosphatase）
2.目的基因的分离方法及其用途
分离方法
基因分离的物理化学方法
鸟枪法
cDNA文库的建立与基因的分离
直接从特定的mRNA中分离基因
基因组文库的建立和基因的分离
从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因
基因的化学合成
利用PCRorRT-PCR分离基因
用途
研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构，功能及其调控
与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗
对策
研究生物种系进化与相关同源性
应用某种基因的大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽
改良某些目的基因，以改良品种
建立基因疗法。
选用某种正常基因，引入患者体内，治疗某些先天性遗传疾病。
3.基因工程载体
一、定义
二、载体具备3的条件：
三、载体的种类：
质粒载体
细菌用的表达载体
λ载体
粘粒载体
M13噬菌体载体
真核细胞用载体
人工染色体（YAC，8BAC，9PAC，10MAC）
4.受体细胞和重组基因的导入
5.基因重组的方法与策略
6.基因重组体的筛选5.2聚合酶链式反应（PCR
第一节PCR基本原理和影响因素
1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（polymerasechainre
action，PCR），1985年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将DNA扩增10^9倍。
1987年PCR得到美国的专利权，PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末PCR产值可达到4x10^8美元。
本章介绍PCR的原理、常用的各种PCR方法及主要应用范围。
一、基本原理
DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。
参与复制的基本因素有：
DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。
PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。
PCR的具体过程如下：
将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。
然后将温度降至引物的Km值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。
当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。
每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。
理论上循环几次，就增加为2^n倍。
当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。
PCR扩增过程见图8-1。
由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。
二、参与PCR反应体系的因素及其作用
参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、反应温度与循环次数、PCR仪等。
现对它们的作用介绍如下：
（一）模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。
当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。
核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。
PCR反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。
DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。
通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。
（二）引物
引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。
因此，引物设计决定PCR反应的成败。
PCR反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。
5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。
对引物的基本要求有：
①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp，因为4^16=4.
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