有关葛根薄层鉴别与提取工艺设计的实验报告.docx
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有关葛根薄层鉴别与提取工艺设计的实验报告
实验一葛根药材的真实性鉴定
1.仪器与材料
1.1仪器
生物显微镜[BA210、Motic]、镊子、载玻片、盖玻片、酒精灯、单（双）面刀片、紫外分析灯（254nm和365nm）[WFH-203B、上海精科实业有限公司]、硅胶HF254板、层析缸、天平[JH202、上海精密科学仪器有限公司]、锥形瓶、超声振荡仪[SB-5200D、宁波新芝生股份有限公司]、量筒、点样毛细管、水浴[XMTE-8112、上海精宏实验设备有限公司]。
1.2试剂
水合氯醛试液、蒸馏水、稀甘油、甲醇[分析纯AR批号:
20120508国药集团化学试剂有限公司]、乙酸乙酯[分析纯AR批号:
T20110822国药集团化学试剂有限公司]、氯仿[分析纯AR批号:
20131227国药集团化学试剂有限公司]。
1.3材料
待鉴定天然药物及对应药材粉末各5份。
5份未知药材分别为葛根（豆科植物野葛Puerarialobata（Willd.）Ohwi的干燥根）、粉葛（混乱品种：
豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的干燥根）、劣质葛根、未知生药1（伪品）、未知生药2（伪品）；葛根制剂愈风宁心片；葛根素对照品、葛根对照药材、粉葛对照药材。
2.实验方法
2.1葛根及粉葛的性状鉴定
观察并记录（文字记录及数码采集图像）药材性状特征，鉴定其是否符合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下标准。
葛根的性状鉴别：
完整的块根呈圆柱形。
表面褐色，具纵皱纹，可见皮孔及须根痕。
质坚实。
饮片呈纵切的长方形厚片或小方块，长5-35cm，厚0.5-1cm。
外皮淡棕色，有纵皱纹，粗糙。
切面黄白色，纹理不明显。
质韧，纤维性强。
气微，味微甜。
粉葛的性状鉴定：
呈圆柱形，类纺锤形或半圆柱形，长12-15cm，直径4-8cm；有的为纵切或横切的厚片，大小不一。
表面黄白色或淡棕色，未去外皮的呈灰棕色。
体重，质硬，富粉性，横切面可见由纤维形成的浅棕色同心性环纹，纵切面可见由纤维形成的数条纵纹。
气微，味微甜。
2.2葛根、粉葛和愈风宁心片的显微鉴定
水装片：
取少许粉末，置于载玻片中央，滴适量蒸馏水，用针将粉末分散均匀，将盖玻片以45°夹角盖上，用大拇指按压盖玻片，无气泡最佳。
用于观察淀粉粒。
水合氯醛装片：
取少许粉末，置于载玻片中央，用解剖针将粉末分散均匀，加1-2滴水合氯醛试液，在酒精灯上透化，重复2-3次透化后加半滴甘油。
将盖玻片与载玻片以45°夹角盖上，用大拇指按压盖玻片，无气泡最佳。
用于观察纤维、导管形态等。
观察并记录（文字记录及数码采集图像）原料药粉末显微特征，鉴定其是否符合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下标准，鉴定其制剂愈风宁心片是否符合该药品质量标准。
葛根的显微特征：
粉末淡棕色。
淀粉粒单粒球形，直径3-37μm，脐点点状，裂缝状或星状；复粒由2-10分粒组成。
纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞大多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。
石细胞少见，类圆形或多角形，直径38-70μm。
具缘纹孔导管较大，具缘纹孔六角形或椭圆形，排列极为紧密。
粉葛的显微特征：
粉末黄白色。
淀粉粒甚多，单粒少见，圆球形，直径8-15μm，脐点隐约可见；复粒多，由2-20分粒组成，纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞大多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。
石细胞少见，类圆形或多角形，直径25-43μm。
具缘纹孔导管较大，具缘纹孔圆形，排列极为紧密。
2.3葛根、粉葛及其制剂的TLC鉴别
葛根素对照品溶液、天然药物原料药及其制剂供试品溶液的制备：
①对照品溶液制备：
取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，制成对照药材溶液。
②药材供试品溶液制备：
天然药物原料药（5个样品）0.1g加甲醇10ml，超声处理20min，将上清液滤出，药液置蒸发皿中水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
③制剂供试品制备：
取愈风宁心片2片，除去包衣，研细，加醋酸乙酯20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。
点样：
按照2015年版《中华人民共和国药典》一部薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述8种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，使成条状。
展开：
以三氯甲烷-甲醇-水（7：
2.5：
0.25）为展开剂，展开，取出，晾干。
结果观察：
置紫外光灯（365nm和254nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应得位置上，显示相同颜色的荧光条斑。
记录（数码照相）实验结果。
3.实验结果（A组）
3.1性状鉴定
观察可得，样品A应为葛根制剂愈风宁心片，青绿色包衣片，除去包衣后显棕褐色；味微苦、甜。
样品B
样品C
样品D
样品E
样品F
外皮颜色
淡棕色
黄白色
淡灰棕色
黄白色
白色或淡黄色
形状
纵切的大小不一的小方块
纵切或斜切的大小不一的小方块
纵切的大小不一的小方块
大小不一的不规则片状及条状
大小不一的小方块
断面
有纵皱纹，粗糙。
切面黄白色，纹理不明显。
横切面可见由纤维形成的浅棕色同心性环纹，纵切面可见由纤维形成的数条纵纹。
有纵皱纹，切面淡棕色，纹理明显，粗糙。
切面黄白色，纹理不明显，有细小孔隙。
表皮纹细、纹理不明显，断面白色细腻，颗粒性。
气味
气微，味微甜。
气微，味微甜。
气微，味微甜。
气微、味微涩。
气微，味微酸。
其它
质韧，纤维性强。
体重，质硬，富粉性，纤维性强。
质韧，纤维性强。
体重，质硬，不易折断。
体重，质坚实。
3.2显微鉴定
样品B
样品C
样品D
样品E
样品F
颜色
淡棕色
黄白色
淡褐色
黄白色
黄白色
淀粉粒
单粒球形，直径3-37μm，脐点点状、裂缝状或星状；复粒由2-10分粒组成。
甚多，单粒少见，圆球形，直径8-15μm，脐点隐约可见；复粒多，由2-20分粒组成。
单粒球形，直径3-37um，脐点点状、裂缝状或星状；复粒由2-10多分粒组成。
单粒扁卵形、类圆形、三角状卵形或矩圆形，脐点点状、人字状、十字状或短缝状，可见层纹；复粒稀少，由2-3分粒组成。
无
晶纤维
纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。
纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞大多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。
纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。
无
可见颗粒状团块，菌丝细长，稍弯曲，有分枝，无色或带棕色，横壁偶可察见
石细胞
少见，类圆形或多角形，直径38-70μm
少见，类圆形或多角形，直径25-43μm
少见，类圆形或多角形，直径38-70μm
少见，类圆形或多角形
少见，类圆形或多角形
具缘纹孔导管
较大，具缘纹孔六角形或椭圆形，排列极为紧密。
较大，具缘纹孔圆形，排列极为紧密。
较大，具缘纹孔六角形或椭圆形，排列极为紧密。
除具缘纹孔导管外还有网纹、螺纹及环纹导管。
无
样品B：
淀粉粒晶纤维
石细胞具缘纹孔导管
样品C：
淀粉粒晶纤维
石细胞具缘纹孔导管
样品D：
淀粉粒晶纤维
石细胞具缘纹孔导管
样品E：
淀粉粒石细胞具缘纹孔导管
样品F：
石细胞晶纤维
3.3TLC鉴别
123456789123456789
（254nm紫外灯下TLC图）（365nm紫外灯下TLC图）
1：
葛根素对照品；2：
野葛对照品；3：
粉葛对照品；4：
样品A--愈风宁心片；5-9：
样品B-F
各组分比移值（Rf）：
Rf1=0.30；Rf2=0.27、Rf2’=0.70；Rf3=0.25；Rf4=0.27、Rf4’=0.68；Rf5=0.27、Rf5’=0.67；Rf6=0.25；Rf7=0.30、Rf7’=0.68
样品8、9无明显荧光现象。
3.4实验结果
通过性状鉴别、显微鉴别、TLC鉴别及Rf值的对比，得出结论：
样品A为愈风宁心片；样品B为葛根；样品C为粉葛；样品D为劣质葛根；样品E为伪品1（推测可能为天麻）；样品F为伪品2（推测可能为茯苓）。
4.讨论与小结
注意事项：
①TLC鉴别点样时点样量不宜过大，易造成拖尾；注意边缘效应，点样时边缘预留出一定距离。
②制片时粉末不宜过大，且需分散均匀，便于观察。
性状鉴别：
观察可得，样品A应为愈风宁心。
片样品C表面黄白色，纵切面可见由纤维形成的数条纵纹，粉性强，推测为粉葛。
样品B、D外表淡棕色，推测可能葛根。
E、F无此特征，推测可能为伪品。
观察其性状，F虽性状类同粉葛，无粉性，有可能为茯苓。
显微鉴别：
样品B、D可观察到单粒球形淀粉粒；含草酸钙方晶的晶纤维且含晶细胞壁木化增厚；少见石细胞，类圆形或多角形；较大的具缘纹孔导管，具缘纹孔六角形或椭圆形，推测可能为葛根。
样品C观察到淀粉粒甚多，单粒少见，复粒多；纤维成束，周围细胞多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚，推测可能为粉葛。
样品E无法观测到晶纤维，样品F无法观测到淀粉粒与具缘纹孔导管，推测其可能为伪品。
TLC鉴别：
与对照品在254nm下相比较，粉末样品A、B、C、D对照品在相应位置上均有颜色相同的斑点。
根据斑点与对照品的比较以及在同样点样量下斑点颜色深浅比较，推论出A是愈风宁心片，B是葛根，C是粉葛，D是劣质葛根。
E、F未显示斑点，为伪品。
总结：
性状鉴定与显微鉴定可以推测样品B、D为葛根，C为粉葛，E、F为伪品，。
TLC鉴定可知样品是否含葛根素以及含量高低，由此区分优葛（B）、劣葛（D）、粉葛（C）和伪品1、2。
综上所述，得出结论：
样品A为愈风宁心片；样品B为葛根；样品C为粉葛；样品D为劣质葛根；样品E为伪品1（推测为天麻）；样品F为伪品2（推测为茯苓）。
实验二葛根总黄酮的提取工艺研究
1.仪器与材料
1.1仪器试剂
旋转蒸发仪【RE-52AA上海亚荣生化仪器厂】、鼓风干燥箱、水浴锅、煎煮锅、玻璃层析柱、纱布、量筒、容量瓶、蒸发皿、移液管、洗耳球、电子天平【JA5002上海精天电子仪器有限公司】、乙醇、甲醇、蒸馏水
1.2实验材料
豆科植物野葛Puerarialobata（Willd.）Ohwi的干燥根【批号140206上海康桥中药饮片有限公司】、AB-8大孔吸附树脂
2.实验方法
2.1水煎提取工艺
取葛根（野葛）饮片80g，置煎煮锅中，加10倍量水（800ml），温室浸泡半小时。
大火煮沸然后小火保持微沸状态1小时，纱布过滤提取液，药渣用8倍量水（640ml）再煮沸半小时，纱布过滤提取液。
合并两次提取的滤液，混合均匀，测量总体积并记录。
精密量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以30%乙醇定容（测试样品1），以备测定水提物总黄酮的含量；奇遇水煎液常压浓缩至1g生药/ml（80ml），另精密量取5.0ml（相当于5g生药量）的药液于已经记录重量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘干称重，计算水煎法浸膏得率。
2.2醇沉纯化工艺
其余水煎浓缩液（75ml）加2倍量95%乙醇（150ml），搅拌，4℃放置约1小时，沉淀。
减压抽滤，测量滤液体积，量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以30%乙醇定容（测试样品2），以备测定水提醇沉纯化后样品总黄酮的含量；减压回收剩余滤液，浓缩至2.5g生药/ml（30ml）。
另精密量取2.0ml相当于5g生药量的药液于已经记录重量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘干，称重，计算水提醇沉纯化法所得浸膏得率。
剩余样品，14ml供药效试验（药理样品A）、14ml供大孔树脂实验。
2.3大孔树脂纯化工艺
取90ml已经预处理好的大孔树脂AB-8吸附剂，装柱，上样14ml（相当于35g生药）葛根提取液，吸附平衡半小时。
先以去离子水洗脱出去水溶性杂质，至检测无多糖反应为止。
再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液，至无黄酮络合反应，测量70%乙醇洗脱液的总体积。
量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以备测定大孔树脂纯化后黄酮含量（测试样品3）。
剩余洗脱液减压浓缩至上样体积（14ml，相当于2.5g生药/ml），精密量取2.0ml（相当于5g生药量）的药液于已经记录重量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘干称重，计算大孔树脂纯化法浸膏得率。
3.实验结果
表1样品中黄酮含量测试
总体积（ml）
样品体积（ml）
稀释倍数
吸光度A
样品浓度（
μg/ml）
总黄酮含量（mg）
测试样品1
715
0.5
500
0.597
8.3110
2971.17
测试样品2
202
0.5
1250
0.607
8.4508
2133.82
测试样品3
106
0.5
1000
0.525
7.3044
774.27
表2不同提取纯化工艺结果的比较
提取方法
浸膏得率（%）
总黄酮含量（%）
总黄酮提取率（%）
水提
18.2
20.41
36.10
水提醇沉
11.8
24.11
27.66
大孔树脂纯化
4
55.31
21.51
4.讨论与小结
天然药物中化学成分的组成一般比较复杂，往往有效成分和其他杂质共存，各成分含量差别也比较大。
分离纯化技术有利于提高产品有效成分的含量，确保天然药物的质量、疗效和稳定性。
常用的提取方法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法等。
常用的纯化方法有沉淀法、结晶法、色谱法等。
本实验通过水煎提取法、水提醇沉法和大孔树脂纯化法三种提取方法来进行葛根不同提取工艺结果的比较。
目前大孔吸附树脂吸附法是工业上最常用的有效部位富集方法之一。
大孔吸附树脂是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体。
以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸附条件可以分离纯化某一个或某一类化合物。
通过总黄酮含量的比较，大孔树脂纯化后总黄酮含量高达55.31%，而水提方法下总黄酮含量只有20.41%，可见大孔树脂的纯化具有很大的优势。
含量仍不够高可能是实验过程中人为误差导致，也可能是样本数量过少导致
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