氨基酸薄层层析实验报告doc.docx

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氨基酸薄层层析实验报告doc

氨基酸薄层层析实验报告

篇一：

生物化学实验-氨基酸分析实验报告

　　【实验报告第一部分（预习报告内容）：

①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：

　　XX

　　】

　　一、预习报告

　　?

实验原理：

　　根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。

薄层层析是在玻

　　璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。

　　薄层层析（thinlayerchromatography，TLC）：

是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。

并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。

　　本次实验：

　　?

具体原理：

当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不

　　一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

　　?

吸附剂（固定相）：

硅胶（C.P.）。

为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基

　　纤维素钠（CMCNa）作黏合剂。

　　?

展开剂：

正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:

10:

10,V/V/V）。

?

展层-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。

?

活化（activation）：

在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。

可使硅胶的

　　活性提高，吸附能力加强。

　　?

氨基酸与茚三酮的显色反应：

茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，

　　此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

?

Rf值：

　　Rf?

　　斑点中心到样品原点的距离

　　对应溶剂前沿到样品原点的距离

　　由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，

　　因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

?

　　实验材料：

　　?

样品：

　　1、0.01mol/L丙氨酸;2、0.01mol/L精氨酸;3、0.01mol/L甘氨酸;4、混合氨基酸溶液。

?

试剂：

1、硅胶（C.P.）

　　2、0.5%羟甲基纤维素钠（CMCNa）

　　3、层展-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀的展开剂（正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:

10:

10,V/V/V））和0.1%茚三酮溶液。

?

仪器及器材：

1、层析版（6cm×15cm）2、小烧杯3、量筒（10ml）4、刻度尺5、铅笔6、毛细玻璃管7、层析缸8、烘箱9、天平10、药匙

　　?

　　实验步骤：

　　?

实验流程：

　　?

　　操作步骤：

?

注意事项：

　　1、玻璃板要清洁平整无油污；2、去掉玻璃板侧缘的硅胶粉，否则层析时会有较强的边缘效应；3、点样时轻触疾起，避免重复点样和斑点过大产生交叉和拖尾；4、毛细玻璃管用完放回原来的烧杯里；5、避免用手接触层析板，避免用手握层析板的下半部分；6、层析板放入层析缸时底端应放置水平，以防倾斜放置使展层方向与薄板下缘不垂直，不好处理数据；7、样点不能浸入到溶液中；8、层析缸盖应作密封处理防止挥发。

　　【实验报告第二部分（实验记录）：

①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。

评分（满分20分）：

　　XX】

　　二、实验记录

　　（一共做了两组实验，以作对照）

　　?

主要实验条件：

　　?

材料：

1、硅胶（C.P.）

　　2、玻璃板。

要求干净干燥。

?

试剂：

　　1、0.5%的羧甲基纤维素钠8ml

　　2、0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸溶液。

各取毛细管2cm高左右，扩散不超2mm

　　3、展层-显色液，层析缸内深度1-2cm?

操作要点：

　　1、制板时，尽量快地将混合匀浆倒在玻璃板上，易于铺匀。

　　2、层析板晾干时尽量保持水平，避免强风猛吹，否则制作的板厚薄不均。

3、活化时烘干以背面无水渍为准。

4、点样时要轻触疾起。

　　5、点样完毕将层析板放入层析缸时，要保持层析板下缘水平。

6、展层-显色剂液面应低于点样线，展层剂前沿大概跑到1/2处时取出

　　7、避免手触碰层析板和点样端边缘。

篇二：

氨基酸的薄层层析

　　实验4氨基酸的薄层层析

　　一、实验原理

　　薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。

由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。

　　薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。

本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的Rf值（Rf值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。

　　氨基酸的显色反应：

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。

　　二、实验材料

（一）样品

　　1．氨基酸标准溶液：

（1）0.01mol/L丙氨酸：

称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

（2）0.01mol/L精氨酸：

称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

（3）0.01mol/L甘氨酸：

称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

　　2．混合氨基酸溶液：

将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。

（二）试剂1．硅胶G（C.P.）

　　2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：

取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静臵冷却，弃沉淀，取上清备用。

　　3．展开溶剂：

按80:

10:

10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。

4．0.1%茚三酮溶液：

取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。

5．展层-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。

　　（三）仪器及器材

　　1．层析板（6×15cm）；2．小烧杯；3．量筒（10mL）；4．小尺子；5．吹风机；6．毛细玻璃管；7．层析缸；8．烘箱。

　　三、实验步骤

（一）实验流程

（二）操作步骤1．制板

　　↓

（1）调浆：

称取硅胶3g，加0.5%的羧甲a.玻璃板要清洁平整，无油污。

基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。

　　b.粘在玻璃板侧面边上的硅胶

（2）涂布：

取洁净的干燥玻璃板a均匀涂粉应去掉，否则在层析时会有较层b。

　　强的边缘效应。

　　（3）干燥：

将玻璃板水平放臵，室温下c.应逐步加温，温度过高易导致放臵0.5h，自然凉干。

　　c

　　（4）活化：

70℃烘干60分钟。

　　涂层裂开。

　　2．点样

　　↓

（1）标记：

用铅笔距底边2cm水平线上a.用冷风吹干，避免破坏氨基酸。

均匀确定4个点并做好标记。

每个样品间最好从玻板背面吹。

相距1cm。

　　b.重复点样时必须等第一点样品

（2）点样：

用毛细管分别吸取丙氨酸、干后再点第二点。

精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。

加样原点扩散直径不超过2mm。

点样后用电吹风a轻轻吹干，必要时重复加样b。

　　3．层析

　　↓

　　将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-a.样点不能浸入到溶液中。

　　显色剂液面应低于点样线a。

盖好层析缸b.将层析缸盖涂上凡士林，防止盖b，上行展层。

当展层剂前沿离薄板顶层析液挥发。

端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。

　　图9-8薄层层析装臵

　　4．显色

　　用热风吹干或在90℃下烘干30min，即可显出各层斑点。

　　（三）注意事项1．吸附剂

　　薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如果颗粒太大，展开时溶剂推进速度太快，分离效果不好。

反之，颗粒太小，展开时太慢，斑点易拖尾，分离效果不好。

　　2．点样

　　点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品量太少时，有的成分不易显示，样品量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离，点样后的斑点直径一般为0.2cm。

　　3．避免污染

　　整个层析过程中，避免用手接触层析板，必要时戴上手套。

　　四、结果与讨论

（一）结果1．层析结果：

　　图9-9氨基酸薄层层析结果图

　　2．数据记录

　　按照下表记录各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离（a）及溶剂前缘至样品原点中心距离（b）

　　色斑中心至样品原

　　各斑点

　　点中心距离（a）

　　丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点3

　　平均a值

　　点中心距离（b）

　　溶剂前缘至样品原

　　溶剂前缘至样品原点中心距离（b）

　　3．结果计算与记录

　　Rf?

　　原点到层析斑点中心的原点到溶剂前沿的距离

　　距离

　　各斑点

　　Rf值

　　氨基酸名称

　　丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点3

　　4．常见问题及处理

　　问题

　　———

　　解析

　　硅胶颗粒太小；层析液因为挥发浓度降低。

茚三酮因存放时间长失效；显色时未用热风吹干，或

（1）斑点拖尾，不集中

（2）斑点未显色

　　者烤箱温度不足。

篇三：

氨基酸薄层层析

　　一、实验目的

　　1、理解并掌握薄层层析法的原理。

　　2、掌握氨基酸薄层层析法的正确的操作步骤。

　　3、掌握根据不同物质的移动速率（Rf值）来鉴定被分离的混合物的各种组分。

氨基酸薄层层析

　　二、实验原理

　　1.薄层层析原理

　　薄层层析时一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）

　　2.氨基酸与茚三酮的显色反应

　　茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

　　3.基于相对迁移率Rf值判定混合氨基酸组分

　　薄层层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值

　　即：

Rf=原点到层析斑点中心的距离

　　原点到溶剂前沿的距离

　　因为物质在一定溶剂中的分配系数是一定值，故其移动速率（Rf值）也是

　　恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

　　三、材料与方法

　　A材料：

　　1样品：

（1）0.01mol/L丙氨酸：

称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。

（2）0.01mol/L精氨酸：

称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。

　　（3）0.01mol/L甘氨酸：

称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。

　　（4）混合氨基酸溶液：

将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液

　　2试剂：

（1）硅胶G（C.P）。

（2）0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：

取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。

　　（3）展开溶剂：

按80:

10:

10比例（V/V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制

　　（4）0.1%茚三酮溶液：

取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。

　　（5）展层-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。

3仪器及器材：

　　①层析板（6cmx15cm）；②小烧杯；③量筒（10ml）；④小尺子；⑥毛细玻璃管；⑦层析缸；⑧烘箱

　　B实验步骤

　　薄层层析的具体操作步骤：

　　四、结果与讨论

　　结果：

　　A层析结果

　　注：

层析结果图从左到右依次顺序为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、混合氨基酸

　　B实验数据：

　　表1各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及溶剂前缘至样品原点中心距离记

　　录

　　测定次数各氨基酸色斑中心至原点中心的距离

　　丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点313.122.551.503.052.451.5123.112.541.503.042.461.5133.122.551.513.052.451.50平均a值3.112.541.503.042.451.50溶剂前缘至样品3.153.654.653.103.694.64原点中心距离6.266.196.156.146.146.14

　　单位（cm）