(三)化学性质
1.氨基的反应
(1)与亚硝酸作用
氨基酸在室温下与亚硝酸反应,脱氨,生成羟基羧酸和氮气。
常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。
这也是Vanslyke法测定氨基氮的理论基础。
(2与甲醛反应
氨基还可以与甲醛反应,生成羟甲基化合物。
由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在,所以不能用酸碱滴定测定含量。
与甲醛反应后,氨基酸不再是偶极离子,其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示,因而可以滴定,这叫甲醛滴定法,可用于测定氨基酸。
(3)与DNFB反应-Sanger反应
氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸)。
这一反应是定量转变的,产物黄色,也叫桑格尔试剂,现在应用于蛋白质N-末端测定。
(4)与异硫氰酸苯酯(PITC)反应-Edman反应
α-氨基与PITC(异硫氰酸苯酯)在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物(PTC-AA),这个反应首先是Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸,在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位,是氨基酸自动序列分析仪的工作原理。
(5)磺酰化
氨基酸与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl,丹磺酰氯)反应,生成DNS-氨基酸。
产物在酸性条件下(6NHCl)100℃也不破坏,因此可用于氨基酸末端分析。
DNS-氨基酸有强荧光,激发波长在360nm左右,比较灵敏,可用于微量分析。
2.羧基的反应
羧基可与碱作用生成盐;羧基可与醇生成酯,此反应常用于多肽合成中的羧基保护。
3茚三酮反应
氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热,引起脱氨、脱羧反应,最后生成蓝紫色物质(570nm)。
而脯氨酸生成黄色化合物(440nm)。
常用于氨基酸的定性定量分析.也可通过二氧化碳测定氨基酸含量。
4.以下反应常用于氨基酸的检验:
酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly反应),可用于定性、定量测定。
组氨酸生成棕红色的化合物,酪氨酸为桔黄色。
精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反应(Sakoguchi反应),生成深红色,称为坂口反应。
用于胍基的鉴定。
酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应(Millon反应),生成白色沉淀,加热后变红,称为米伦反应,是鉴定酚基的特性反应。
色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸,在界面会出现紫色环,用于鉴定吲哚基。
(glyoxalate反应)
酪氨酸在碱性条件下与福林试剂反应(Folin)反应,生成蓝色化合物。
第三节蛋白质的一级结构
一、肽键和肽
一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的共价键,称为肽键。
在蛋白质分子中,氨基酸借肽键连接起来,形成肽链。
最简单的肽由两个氨基酸组成,称为二肽。
含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。
//肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水,已不是完整的氨基酸,所以称为残基。
//肽的命名是根据组成肽的氨基酸残基来确定的。
一般从肽的氨基端开始,称为某氨基酰某氨基酰„某氨基酸。
肽的书写也是从氨基端开始。
即有方向性,从N端C端。
//有主侧链之分,主链完全一样,仅R不同。
//除了蛋白质部分水解可以产生各种简单的多肽以外,自然界中还有长短不等的小肽,它们具有特殊的生理功能.这些天然肽中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。
//许多激素也是多肽,如催产素、加压素、舒缓激肽等。
三、一级结构的测定(168)
(一)一级结构(即化学结构、共价结构)
蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。
氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础,它决定蛋白质的高级结构。
一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示,从N-末端向C-末端书写。
采用三字母符号时,氨基酸之间用连字符(-)隔开。
例如,牛胰核糖核酸酶,124个氨基酸;胰岛素,51个氨基酸。
(二)测定步骤
测定蛋白质的一级结构,要求样品必须是均一的(纯度大于97%)而且是已知分子量的蛋白质。
一般的测定步骤是:
1.通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。
2. 将每条肽链分开,并分离提纯。
3. 肽链的一部分样品进行完全水解,测定其氨基酸组成和比例。
4. 肽链的另一部分样品进行N末端和C末端的鉴定。
5. 拆开肽链内部的二硫键。
6. 肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段,并将各个肽段分离出来。
7. 测定每个肽段的氨基酸顺序。
8. 从第二步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段,其断裂点与第五步不同。
分离肽段并测序。
比较两套肽段的氨基酸顺序,根据其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。
9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。
(三)常用方法 1. 末端分析
(1)N末端
2,4-二硝基氟苯(DNFB) 丹磺酰氯法
异硫氰酸苯酯(PITC)法 酶学方法即氨肽酶法测定
(2)C末端 硼氢化锂 肼解法 羧肽酶法
第四节 蛋白质的高级结构
一、蛋白质的三维构象,也称空间结构或高级结构,是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。
高级结构是蛋白质表现其生物功能或活性所必须的,包括二级、三级和四级结构。
二、结构
蛋白质的分子结构可人为分为一级、二级、三级和四级结构等层次。
一级结构为线状结构,二、三、四级结构为空间结构。
1.一级结构:
指多肽链中氨基酸的排列顺序,其维系键是肽键。
蛋白质的一级结构决定其空间结构。
2.二级结构:
指多肽链主链骨架盘绕折叠而形成的构象,借氢键维系。
主要有以下几种类型:
⑴α-螺旋:
其结构特征为:
①主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋;②螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基,螺距为0.54nm;③ 相邻螺旋圈之间形成许多氢键;④ 侧链基团位于螺旋的外侧。
影响α-螺旋形成的因素主要是:
① 存在侧链基团较大的氨基酸残基;② 连续存在带相同电荷的氨基酸残基;③ 存在脯氨酸残基。
⑵β-折叠:
其结构特征为:
① 若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片;② 所有肽键的C=O和N—H形成链间氢键;③侧链基团分别交替位于片层的上、下方。
⑶β-转角:
多肽链180°回折部分,通常由四个氨基酸残基构成,借1、4残基之间形成氢键维系。
⑷无规卷曲:
主链骨架无规律盘绕的部分。
3.三级结构:
指多肽链在二级结构的基础上通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠,借助次级键形成的特定的空间 构象,是多肽链中所有原子的空间排布。
其维系键主要是非共价键(次级键):
氢键、疏水键、范德华力、离子键等,也可涉及二硫键。
4.四级结构:
指由两条或两条以上具备三级结构的多肽链以次级键相互缔合而成的聚集体,它是亚基之间的立体排布、接触部位的布局等,其维系键为非共价键。
亚基是指参与构成蛋白质四级结构的而又具有独立三级结构的多肽链。
亚基数目多为偶数,个别为奇数;它们单独存在时,通常不表现生物活性.
5.超二级结构
相邻的二级结构单元可组合在一起,相互作用,形成有规则,在空间上能辨认的二级结构组合体,充当三级结构的构件,称为超二级结构。
常见的有三种:
αα βαβ βββ
6.结构域:
在二级结构和超二级结构的基础上形成的三级结构的局部折叠区,是相对独立的三维实体,它是球状蛋白质的折叠单位.
7维持蛋白质构象的作用力包括共价键和非共价键.
第五节 蛋白质结构与功能的关系
蛋白质多种多样的生物功能是以其化学组成和极其复杂的结构为基础的。
这不仅需要一定的结构还需要一定的空间构象。
蛋白质的空间构象取决于其一级结构和周围环境,因此研究一级结构与功能的关系是十分重要的。
一、蛋白质的一级结构与高级结构
核糖核酸酶的变性复性实验说明了一级结构决定其高级结构。
二、蛋白质一级结构与功能的关系
(一) 种属差异
同源蛋白质是指在不同的有机体内实现同一功能的蛋白质.如胰岛素和细胞色素C.
(二)分子病
蛋白质分子一级结构的改变有可能引起其生物功能的显著变化,甚至引起疾病。
这种现象称为分子病。
突出的例子是镰刀型贫血病。
这种病是由于病人血红蛋白β链第六位谷氨酸突变为缬氨酸,这个氨基酸位于分子表面,在缺氧时引起血红蛋白线性凝集,使红细胞容易破裂,发生溶血。
血红蛋白分子中共有574个残基,其中2个残基的变化导致严重后果,证明蛋白质结构与功能有密切关系。
(三)共价修饰
对蛋白质一级结构进行共价修饰,也可改变其功能。
如在激素调节过程中,常发生可逆磷酸化,以改变酶的活性。
(四)一级结构的断裂
一级结构的断裂可引起蛋白质活性的巨大变化。
如酶原的激活和凝血过程等。
三、蛋白质的变构现象-高级结构变化对功能的影响
有些小分子物质(配基)可专一地与蛋白质可逆结合,使蛋白质的结构和功能发生变化,这种现象称为变构现象。
变构现象与蛋白质的生理功能有密切联系。
如血红蛋白在运输氧气时,就有变构现象发生。
第六节 蛋白质的性质
一、蛋白质的酸碱性
蛋白质是两性电解质,分子中的可解离基团主要是侧链基团,也包括末端氨基和羧基。
蛋白质也有等电点,即所带净电荷为零的pH值。
蛋白质在等电点时净电荷为零,因此没有同种电荷的排斥,所以不稳定,溶解度最小,易聚集沉淀。
同时其粘度、渗透性、膨胀性以及导电能力均为最小。
各种蛋白的等电点不同,在同一pH时所带电荷不同,在一电场作用下移动的方向和速度也不同,所以可用电泳来分离提纯蛋白质。
二、蛋白质的胶体性质
蛋白质是大分子,在水溶液中的颗粒直径在1-100纳米之间,是一种分子胶体。
利用半透膜如玻璃纸、火胶棉、羊皮纸等可分离纯化蛋白质,称为透析。
蛋白质的水溶液是亲水的胶体溶液。
稳定因素是水化层与双电层。
三、蛋白质的沉淀反应—破坏水膜和电荷
1、 可逆的沉淀作用:
盐析与盐溶
2、 不可逆的沉淀作用:
有机溶剂、重金属、生物碱试剂
四、蛋白质的变性
1.定义:
天然蛋白因受物理或化学因素影响,高级结构遭到破坏,致使其理化性质和生物功能发生改变,但并不导致一级结构的改变,这种现象称为变性。
变性因素:
如强酸、强碱、重金属盐、尿素、胍、去污剂、三氯乙酸、有机溶剂、高温、射线、超声波、剧烈振荡或搅拌等。
2.表现:
生物学活性丧失
分子性质也改变,如粘度升高,溶解度降低,结晶能力丧失,旋光度和红外、紫外光谱均发生变化。
同时包埋在分子内部的可反应基团暴露出来,反应性增加。
蛋白质变性后失去生物活性,抗原性也发生改变。
原因主要是高级结构的改变。
氢键等次级键被破坏,肽链松散,变为无规卷曲。
3.复性:
某些变性的蛋白质在一定的条件下能够恢复原来的空间构象,其生物学活性也恢复的过程。
4.变性的防止和利用 :
研究蛋白质的变性,可采取某些措施防止变性,如添加明胶、树胶、酶的底物和抑制剂、辅基、金属离子、盐类、缓冲液、糖类等,可抑制变性作用。
变性现象也可加以利用,如用酒精消毒,就是利用乙醇的变性作用来杀菌。
在提纯蛋白时,可用变性剂除去一些易变性的杂蛋白。
五、蛋白质的颜色反应
蛋白质中的一些基团能与某些试剂反应,生成有色物质,可作为测定根据。
常用反应如下:
1.双缩脲反应,形成红紫色络合物。
此反应可用于定性鉴定,也可在540nm比色,定量测定蛋白含量。
2.黄色反应 ,含有芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质在溶液中遇到硝酸后,先产生白色沉淀,加热则变黄,再加碱颜色加深为橙黄色。
六.蛋白质的分子量测定
(一)根据化学组成测定最低分子量
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量,并假设分子中只有一个这种元素的原子,就可以计算出蛋白质的最低分子量。
例如,肌红蛋白含铁0.335%,其最低分子量可依下式计算:
最低分子量=铁的原子量÷铁的百分含量×100
(二)渗透压法
(三)沉降分析法
(四)分子排阻层析法
(五)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(298)
第二章 核酸化学
第一节 概述
一、核酸分子的发现
Miescher被认为是细胞核化学的创始人和DNA的发现者。
二、核酸的分类与分布
核酸分为DNA和RNA两类,DNA主要集中在细胞核中,线粒体和叶绿体中也有少量DNA。
原核细胞DNA分布在类核区域,质粒里也有分布。
RNA主要分布在细胞质中。
对病毒来说,或只含DNA,或只含RNA。
因此可将病毒分为DNA病毒和RNA病毒。
核酸可分为单链和双链。
DNA一般为双链,作为信息分子;RNA一般为单链。
RNA按功能分为三类:
转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和核糖体RNA(rRNA)。
此外还有snRNA和hnRNA。
前者与RNA的加工有关,后者是mRNA的前体。
三、核酸的功能
DNA是主要的遗传物质.
RNA参与蛋白质的生物合成.即装配与催化;转换器并携带氨基酸;信使的功能。
RNA功能的多样性:
控制蛋白质的合成; RNA转录后加工与修饰;基因表达与细胞功能的调节;生物催化及其他细胞持家功能;遗传信息的加工与进化。
核心是基因表达的信息加工和调节,即遗传信息的表达和调控。
第二节 核苷酸
一、核苷酸的结构
核苷酸可分解成核苷和磷酸,核苷又可分解为碱基和戊糖。
戊糖有两种,D-核糖和D-2-脱氧核糖。
因此核酸可分为两类:
DNA和RNA。
(一)碱基
核酸中的碱基分为两类:
嘌呤和嘧啶。
1.嘧啶碱 是嘧啶的衍生物,共有三种:
胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
其中尿嘧啶只存在于RNA中,胸腺嘧啶只存在于DNA中。
胞嘧啶为两类核酸所共有。
2.嘌呤碱 由嘌呤衍生而来,常见的有两种:
腺嘌呤(和鸟嘌呤。
3.稀有碱基:
除以上五种基本的碱基以外,核酸中还有一些含量极少的稀有碱基,其中大多数是甲基化碱基。
甲基化发生在核酸合成以后,对核酸的生物学功能具有重要意义。
核酸中甲基化碱基含量一般不超过5%,但tRNA中可高达10%。
(二)核苷
核苷是戊糖与碱基缩合而成的。
糖的第一位碳原子与嘧啶的第一位氮原子或嘌呤的第九位氮原子以糖苷键相连,一般称为N-糖苷键。
稀有核苷:
由稀有碱基或甲基化的糖环形成的,以及碱基与戊糖之间以非正常N-C键相连而形成的。
如在tRNA中含有少量假尿嘧啶核苷(用Ψ表示),它的核糖与嘧啶环的C5相连。
(三)核苷酸
核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化,就形成核苷酸。
核糖核苷的糖环上有三个羟基,可形成三种核苷酸:
2’、3’和5’-核糖核苷酸。
脱氧核糖只有3’和5’两种。
生物体内游离存在的多是5’核苷酸。
(四)多磷酸核苷酸
细胞内有一些游离的多磷酸核苷酸,它们具有重要的生理功能。
5’-NDP是核苷的焦磷酸酯,5’-NTP是核苷的三磷酸酯。
//最常见的是5’-ADP和5’-ATP。
ATP上的磷酸残基由近向远以αβγ编号。
外侧两个磷酸酯键水解时可释放出7.3千卡能量,而普通磷酸酯键只有2千卡,所以被称为高能磷酸键(~P)。
因此ATP在细胞能量代谢中起极其重要的作用,许多化学反应需要由ATP提供能量。
鸟嘌呤核苷四磷酸酯和五磷酸酯在代谢调控中起作用,在大肠杆菌中,它们参与rRNA合成的控制。
(五)环化核苷酸
磷酸同时与核苷上两个羟基形成酯键,就形成环化核苷酸。
最常见的是3',5'-环化腺苷酸(cAMP) 和cGMP。
它们是激素作用的第二信使,起信号传递作用。
可被磷酸二酯酶催化水解,生成相应的5'-核苷酸。
二、有关缩写符号
碱基用三字母符号表示,核苷用大写单字母符号表示,前面加d表示脱氧核苷。
戊糖的原子用带’的数字编号,碱基用不带’的数字编号。
稀有核苷(修饰核苷)也用单字母符号表示,如D表示二氢尿嘧啶核苷,T表示胸苷。
如果碱基上有修饰基团,就在表示核苷的大写字母前加上代表修饰基团的小写字母,在这个小写字母的右上方写明修饰位置,右下方写明修饰基团的数量(如只有一个可省略)。
如m2
G表示2-N-甲基鸟苷,m2,2,73
G表示N2,N2,7-三甲基鸟苷,S4
U表示4-硫代尿苷。
核糖上的修饰基团
写在表示核苷的大写字母右边,如Cm表示2'-O-甲基胞苷。
核苷酸可在核苷符号旁加小写p表示,写在左边表示5'核苷酸,写在右边表示3'核苷酸。
写几个就表示几个磷酸。
3',5'-环化核苷酸可在前面加小写c,2',3'-环化核苷酸可在核苷符号后加〉P,如U〉P表示2',3'-环化尿苷酸。
三、核苷酸的功能
1.作为核酸的单体。
2.为需能反应提供能量。
UTP用于多糖合成,GTP用于蛋白质合成,CTP用于脂类合成,ATP用于多种反应。
3。
用于信号传递。
4.参与构成辅酶。
5.参与代谢调控。
6.食品工业上用作添加剂。
第三节 DNA的结构
一、DNA的一级结构
1.定义:
DNA是由成千上万个脱氧核糖核苷酸聚合而成的没有分支的长链。
它的一级结构是指四种脱氧核糖核苷酸的组成及排列顺序,即碱基序列。
生物界物种的多样性即寓于DNA分子四种核苷酸千变万化的排列之中。
2.结构:
在DNA分子中,前一个核苷酸的3’-羟基与后一个核苷酸的5’-磷酸结合,即相邻核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接构成长链。
//链中磷酸与糖交替排列构成主链骨架,而代表其特性的碱基则是侧链;主链亲水,呈酸性;侧链疏水。
//方向性:
链的一端有自由的5’-磷酸基,称为5’端;另一端有自由3’-羟基,称为3’端。
3.表示法 :
书写DNA时,按从5’向3’方向从左向右进行,并在链端注明5’和3’,如5’pApGpCpTOH3’。
也可省略中间的磷酸,写成pAGCT。
这是文字式缩写。
还有线条式缩写,用竖线表示戊糖,1'在上,5'在下。
二、DNA的二级结构
(一)双螺旋结构建立的主要依据有:
已知核酸的化学结构和核苷酸键长键角的数据。
DNA碱基组成的规律 1950年,Chargaff发现在任何DNA中,A=T,G=C。
(二)B-DNA双螺旋结构的要点
1.基本结构:
DNA双螺旋是由两条反向平行的多核苷酸围绕同一个中心轴右手盘旋而成,螺旋表面有大沟和小沟,大沟