油茶camelliaoleiferaabel三萜皂苷的分离纯化.docx
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油茶camelliaoleiferaabel三萜皂苷的分离纯化
青岛农业大学
毕业论文
题目：
油茶（CamelliaoleiferaAbel）三萜皂苷的分离纯化
姓名：
346767
学院：
园艺学院
专业：
茶学
班级：
2010级1班
学号：
20103324
指导教师：
张新富
2014年6月15日
油茶（CamelliaoleiferaAbel）三萜皂苷的分离纯化
茶学专业冯钰
指导老师张新富
摘要：
从天然产物中寻找全新结构的活性物质是现代科学研究的一大趋势，三萜皂苷是其中的热点。
油茶三萜皂苷是油茶饼粕中主要的活性成分，但其单体的相关报道较少。
本研究以油茶三萜皂苷粗品为材料，利用AB-8大孔树脂吸附油茶三萜皂苷，30%乙醇洗脱出色素等杂质，80%乙醇洗脱出油茶总皂苷，得率为16.6%；硅胶柱进一步分离纯化油茶三萜皂苷，洗脱系统为二氯甲烷：
甲醇：
水=65:
50:
8，得率为64.73%；ODS-C18OPN纯化油茶三萜皂苷，50%甲醇洗脱出杂质组分，60%、65%、70%甲醇洗脱出油茶三萜皂苷的不同组分，得率分别为11.76%、23.45%、49.25%，其纯度进一步得到提高；HPLC分离油茶三萜皂苷，0.2%乙酸-乙腈系统进行洗脱，得到两个单峰组分。
单体化合物的获得为油茶三萜皂苷构效关系的研究奠定了基础。
关键词：
油茶；三萜皂苷；分离；大孔树脂；液相色谱分析
TheApplicationSeparationandPurificationTechnologiesofCamelliaoleiferaAbel
StudentmajoringinteascienceFengYu
TutorZhangXin-fu
Abstract:
Lookingfornewactivesubstancesfromnaturalproductsisamajortrendinmodernscientificresearch,andtriterpenoidsaponinsisoneofthehotspots.Triterpenoidsaponinsarethemainactivecomponentsinteaseedpomace（Camelliaoleifera）,whichareveryfewreportsdescribingsuccessfulisolationofsaponinmonomers.InthisstudythecrudesaponinswerefirstlysubjectedtoAB-8macroporousresincolumnchromatographywithstepwisegradientsofethanolandwater（atrationsof30:
70,80:
20,v/v）,itsyieldis16.6%;Thentriterpenoidsaponinswerepurifiedbysilicagelcolumnwiththeelutionsystem（dichloromethane:
methanol:
water=65:
50:
8）,theyieldis64.73%;TriterpenoidsaponinswerefurtherpurifiedbyODS-C18OPN,50%methanolelutingtheimpuritycomponents,and60%,65%and70%methanolelutingdifferentsaponins,therateswere11.76%,23.45%and49.25%respectively,sothepurityofsaponinsisfurtherimproved;FinallytriterpenoidsaponinswerepurifiedbyHPLC,0.2%aceticacidacetonitrilesystemforelution,twosinglecomponentswereisolated.Theobtainingofmonomercompoundshaslaidthefoundationfortheresearchoftriterpenoidsaponinsstructure-activityrelationship.
Keywords:
Camelliaoleifera;triterpenoidsaponin;separate;macroporousresin;HighPerformanceLiquidChromatograph（HPLC）
引言
油茶（CamelliaoleiferaAbel）是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，是我国特有的木本食用油料树种。
茶皂苷，也可称为茶皂素、茶皂甙，是一类结构较为复杂的齐墩果烷型五环三萜类皂甙混合物，是由皂甙元、糖体和有机酸三部分作为基本结构组成的[1,2]。
油茶籽粕中茶皂苷的含量为10%左右，茶皂苷可以从油茶饼粕中提取而得，是一种具有优良性能的天然非离子型表面活性剂，具有良好的的表面活性以及生物活性，其乳化、发泡、润湿、分散作用显著，并具有溶血、消炎镇痛、抗渗透、抗氧化、抑菌杀虫等生物活性[3]，因而被广泛应用于水产养殖业、日用化工业、农业生产、建筑业、医药行业、食品加工等各个领域[4,5]。
油茶皂苷传统提取工艺分为两类：
水浸法、有机溶剂浸出法[3]，有机溶剂提取油茶皂素的方法常用于工业中，主要包括过膜法、萃取法、沉淀法、大孔树脂层析法等，但是此类方法分离后纯度较低，其中还会掺杂糖类、蛋白质、色素等杂质，后期还需进行更细致地分离纯化[6]。
目前关于油茶皂苷的分离纯化方法主要有柱层析法、薄层层析法、高效液相色谱分离法等[7]。
水浸法生产油茶皂苷成本低、无污染、投资少、生产简便、见效快，不需用有机溶剂，但是生产油茶皂苷的效率低，产物杂质多，并且损耗大，造成提皂后残渣的营养成分大量流失，降低了提皂后残渣的可饲用性。
有机溶剂浸出法生产油茶皂苷效率高、能耗少，产品杂质含量少，但产品成本高、设备复杂、溶剂损耗大，并且用甲醇提取时若设备密封不好会因甲醇挥发而造成对人体的毒害[6,7]。
薄层层析法对于结构相似的成分不能达到较好的分离效果；高效液相色谱分离法虽然灵敏度高、分离速度快，但需要较为完备的仪器设备，并且得到的色谱峰较为集中，分离度较低，保存时间短[8]。
大孔树脂层析法是柱层析法的一种，运用树脂提取分离油茶皂苷的生产工艺是采用水浸提法，利用树脂所具有的选择吸附性能来富集、分离油茶皂苷，用一定浓度的乙醇溶液进行洗脱，回收洗脱剂可获得较纯的油茶皂苷粗品[9]。
研究发现，离子交换树脂对油茶皂苷的吸附容量较高，洗脱率相对较低。
张新富等（2012）采用了不同孔径、不同比表面积的大孔树脂进行对比分析实验，结果表明：
与其他几种型号的树脂相比，AB-8大孔树脂对油茶皂苷的吸附率和洗脱率较强，均达到85%以上，而且使用不同浓度梯度的乙醇溶液进行解吸时可以有效除去色素、糖类、蛋白质、黄酮类等杂质[10]。
因此选择AB-8大孔树脂层析法纯化油茶皂苷，利用该树脂以水洗脱可以得到色素、茶多糖和蛋白质，30％-40％的乙醇洗脱得到茶多酚和黄酮，60％左右的乙醇洗脱可得到油茶皂苷，继而可以使茶叶中所含的多糖、色素、蛋白质、茶多酚、油茶皂苷等初步分离开来[10-12]。
HPLC分离纯化技术是目前较为先进的油茶皂苷分离技术，其灵敏度高、分离速度快，多用于油茶皂苷的最终分离[13-15]。
关于茶皂苷单体的报道，研究材料主要集中在茶树（Camelliasinensis）的根、叶、花和种子。
关于茶皂苷的探索开始于19世纪末，日本名为青山新次郎的学者在1931年初次从茶树种子中提取出茶皂苷，命名为“Saponin”，而且在其水解实验中得到了糖体以及配基，使茶皂苷实验式的确定成为可能，但是他并没能够从中提取分离出茶皂苷纯结晶[1]。
在随后的几十年里，Masayuki等人对茶树的叶、根、花和种子进行深入研究后分离纯化出56种油茶三萜皂苷单体。
1952年，日本石馆守山以及上田阳在茶籽中提取分离出茶皂苷晶体，并确定了茶皂苷的结构组成：
皂甙元（C30H50O6）与当归酸以及糖体（包括半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸）相结合[16]。
在20世纪60年代之后，随着科学技术的不断发展以及科研人员的不懈探索和研究，茶皂苷的研究得到了进一步的发展，高分子技术的不断优化让茶皂苷化学结构的确定成为可能，高灵敏仪器陆续诞生，茶皂苷的分离鉴定分析方法和分离纯化技术也在不断提高。
目前，高效液相色谱和反相高压液相色谱与质谱相结合已成为分离鉴定茶皂苷的常用方法，尤其是核磁共振技术在茶皂苷单体结构研究领域的应用，为皂苷结构的鉴定提供了便利[8]。
近年来，逐渐报道了一些油茶（Camelliaoleifera）和茶梅（Camelliasasanqua）中的茶皂苷，Huang等从油茶（Camelliaoleifera）饼粕中分离鉴定出一个皂苷物质sasanquasaponin（C58H92O26，SQS），并研究了它对缺氧损伤内皮细胞的作用[17]；KUO等从油茶（Camelliaoleifera）饼粕中分离了一个茶皂苷混合物，并研究了它对立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）的作用[18]；Sugimoto等从油茶（Camelliaoleifera）的花芽中分离鉴定了四个皂苷化合物yuchasaponinsA、B、C、D，并以小鼠为模型研究其对胃的保护作用[19]；MATSUDA等从茶梅（Camelliasasanqua）的花中分离了5个皂苷sasanquasaponinⅠ-Ⅴ，并研究了它们的生物活性[20]。
油茶（Camelliaoleifera）中三萜皂苷的报道远远少于山茶属其他植物，存在很大的研究空间。
本研究以油茶三萜皂苷粗品为材料，采用柱层析法分离纯化油茶三萜皂苷，在大孔树脂初步纯化后将所得样品再进行硅胶柱、ODS-C18OPN柱的分离纯化，最后经HPLC分离得到油茶三萜皂苷单体组分。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1试验材料
实验室前期获得的油茶三萜皂苷粗品。
1.1.2试验试剂
表1试验试剂一览表
Table1Listofexperimentalreagents
试剂名称
规格（型号）
生产厂家
乙醇（95%）
甲醇
二氯甲烷
硫酸铈
硫酸
硅胶板
大孔树脂
柱层层析硅胶
薄层层析硅胶H
ODS-C18OPN
分析纯AR
分析纯AR
分析纯AR
分析纯AR
分析纯AR
试剂级
AB-8型
试剂级（100-200目）
（200-300目）
化学纯
化学纯
莱阳康德化工有限公司
天津市广成化学试剂有限公司
天津市富宇精细化工有限公司
天津市登科化学试剂有限公司
上海山浦化工有限公司
莱阳康德化工有限公司
青岛胜海精细硅胶化工有限公司
沧州宝恩吸附材料科技有限公司
青岛胜海精细硅胶化工有限公司
青岛胜海精细硅胶化工有限公司
青岛海洋化工有限公司
日本YMC
1.2仪器与设备
HPLC（Agilent1260）、大孔树脂吸附柱（100×3.5cm、100×5cm）、硅胶柱（100×5cm）、ODS-C18OPN柱（50×3.0cm）、旋转蒸发仪、数显恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、水循环真空泵、冷冻干燥机、吹风机、电子称、烧杯、玻璃棒、注射器、毛细管、脱脂棉、纱布等。
1.3试验方法
1.3.1大孔树脂分离纯化油茶三萜皂苷
本研究选用AB-8大孔树脂初步分离纯化油茶三萜皂苷，其步骤如下：
（1）装柱：
称取AB-8大孔树脂：
柱①1100g；柱②540g，各用95%浓度的乙醇浸泡四小时以上。
柱①规格为100×5.0cm，柱②为100×3.5cm，装柱前在旋钮端柱口处塞上脱脂棉以防止大孔树脂下漏，将浸泡好的大孔树脂搅拌均匀后倒入柱内，装柱时要注意柱内的乙醇高度要高于大孔树脂，否则树脂内会进入气泡，影响大孔树脂的吸附效果。
（2）蒸馏水洗脱：
用蒸馏水冲柱，洗脱前要在柱内树脂层上放入用纱布包好的脱脂棉，防止加水时树脂翻起。
（实验现象：
放置一晚后柱内出现少量气泡，加水洗脱后树脂高度降低，柱内气泡减少，树脂柱进一步紧实。
）
（3）浸样：
称取600g油茶三萜皂苷粗品用蒸馏水浸泡，搅拌使其溶解均匀。
（4）上样：
将浸好的粗样分别倒入两个柱内，打开旋钮，等整个柱子变色、流出液中泡沫丰富时说明吸附完全。
（5）洗脱：
先用蒸馏水洗脱至流出液为浅黄色，再分别用30%、80%、95%浓度的乙醇梯度洗脱，30%乙醇的加入量约为柱容积的4-5倍，流出液先为红褐色然后逐渐变浅，用80%乙醇洗脱时要收集洗出液，洗脱到柱底接近无色为止，最后用95%乙醇充分洗脱并收集洗出液。
（6）旋转蒸发：
在55℃下将收集的洗出液旋转蒸发，再用水浴锅进一步蒸干浓缩，浓缩液要抽滤除掉其中的残渣。
（7）冷冻干燥：
将洗脱液分装到小烧杯（150ml）中，用保鲜膜封口后冷冻，全部凝固后在保鲜膜上刺多个小孔进行冷冻干燥（-50℃），抽真空时烧杯中会产生泡沫，干燥后的样品（样品A）为浅黄色固体。
1.3.2硅胶柱分离油茶三萜皂苷
（1）配制洗脱液：
二氯甲烷：
甲醇：
水=65:
50:
8。
（2）装柱：
称取硅胶（100-200目），柱③（100×5.0cm）478g、柱④（100×5.0cm）522g，分别用适量洗脱液浸泡并搅拌均匀赶出气泡。
装柱前先在柱内倒入部分洗脱液作为缓冲，装柱时要一气呵成，否则会有断层。
分别量取2500ml的洗脱液循环冲柱，使硅胶压的更紧实，最终硅胶柱高约80cm。
（3）拌样：
各称取15g样品A于小烧杯中，加少量甲醇溶解，再各称取15g硅胶于研钵中，放于水浴锅（60℃）上，将溶解的样品缓慢倒入并搅拌均匀，加热后得到干物质共63g，研成粉末。
（4）湿法上样：
将上步研磨得到的粉末装柱，柱③29.6g、柱④33.4g，再在样品上各加10g硅胶，防止倒入缓冲液时冲起样品。
注意硅胶和样品的铺面一定要平整，这样才能使样品中的洗脱物均匀下沉。
（5）洗脱：
待含颜色的物质接近旋钮口时开始收集流出液（每500ml一组），并做好标注。
（6）干燥：
每组分别进行旋转蒸发，直到流出液蒸发后无明显物质为止，每根柱子各冲出15个组分。
最后将所有组分水浴浓缩、冷冻干燥得样品B。
（7）点板显色：
从中选出质地均匀、颜色较浅的组分，各取少许经甲醇溶解后用毛细管吸取适量点在硅胶板一侧，注意点的大小和颜色，各组分所点的大小要均匀一致，点的颜色较浅时要多点一些。
用吹风机吹干后将硅胶板放于装有缓冲液（二氯甲烷：
甲醇：
水=65:
50:
8）的密封瓶中层析，再次吹干后均匀地喷上显色剂，最后放于电热鼓风恒温干燥箱中以120℃加热显色约1min。
显色剂的配制：
称取0.5g硫酸铈溶于50ml浓度为10%的硫酸溶液中。
观察显色程度，用作分组参考。
1.3.3硅胶柱二次分离油茶三萜皂苷
（1）装柱：
在样品B中，每根柱子的2号组分质量最多且质地均匀、色泽较浅，柱③-2为9.4g、柱④-2为12.6g。
重装两根硅胶柱（柱⑤、柱⑥），每根柱用430g硅胶（200-300目）。
（2）洗脱：
缓冲液配制为二氯甲烷：
甲醇：
水=65:
50:
6，装柱后用缓冲液洗脱柱子，待硅胶柱压紧实后测得两根柱子都高约72cm。
（3）湿法上样：
分别将柱③-2、柱④-2组分用甲醇溶解，经有机膜过滤后各用7g硅胶拌样，分别上样后每根柱子加10g保护硅胶。
（4）干燥：
用缓冲液冲至流出液经旋转蒸发后无明显物质为止，旋转蒸发、冷冻干燥后，柱⑤得9个组分（共8.5876g）、柱⑥得8个组分（共10.8314g）。
（5）液相分析：
挑选色泽较白、质地均匀的组分进行液相分析。
1.3.4ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷
（1）样品选择：
经液相分析后，通过观察比较各组分样品的液相图进行分组，将柱⑤-3至⑤-7和柱⑥-1至⑥-7合并（共16.996g）。
防死吸附：
用甲醇溶解，经滤纸抽滤和有机膜过滤后先用少量C18分离，防止死吸附现象，避免污染后面的整根ODS-C18OPN柱，以纯甲醇为洗脱液，将流出液进行蒸发浓缩、有机膜过滤后得到备用样品溶液（60ml）。
（2）装柱：
将C18（112.5g）装柱，先用纯甲醇冲洗柱子使其更加紧实，再用50%浓度的甲醇将柱内纯甲醇置换出，将样品溶液分四次上样。
（3）洗脱：
分别用50%、60%、65%、70%、100%浓度的甲醇梯度洗脱，每梯度400ml，将柱⑤、柱⑥剩余组分合并作为第5次上样，每次上样前需将ODS-C18OPN柱冲成50%的甲醇浓度，从而使柱内溶液浓度与第一个洗脱梯度的浓度相同，各收集5个组分。
（4）干燥：
将最终冲出的25个组分别进行旋转蒸发、水浴锅浓缩和冷冻干燥后得到样品C。
（5）液相分析：
将得出的固体组分进行液相分析，得到的液相分析图作为下一步中样品选择的依据。
1.3.5ODS-C18OPN二次分离纯化油茶三萜皂苷
（1）样品合并：
从样品C中选出组分1-4、2-4、3-4、4-4合并（共2.389g），并用甲醇溶解，有机膜过滤。
（2）洗脱：
将上步所用的ODS-C18OPN柱用50%的甲醇饱和，上样后分别用60%（450ml）、65%（600ml）、100%（600ml）浓度的甲醇梯度洗脱，流出液需分组收集，60%的流出液全部收集为一组；65%的流出液分3组收集，每组200ml；100%的先收200ml，剩余的为一组，共得出6个组分。
（3）干燥：
将所得的6个组分经旋转蒸发、冷冻干燥后共得1.6159g样品。
（4）各组分的HPLC分析。
1.3.6HPLC分离纯化
通过观察经ODS-C18OPN柱分离纯化后所得组分的液相分析图判断油茶三萜皂苷的分离纯化程度，选择峰较明显、峰的数量较少的组分进一步进行HPLC分离纯化。
HPLC条件：
AglilentZorbaxEclipsePlusC18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱，检测波长：
280nm，柱温箱温度设定：
25℃，流速1.0mL∕min，A相：
0.2%乙酸，B相：
乙腈，0-10minB相由35%升至38%，20min升至42%。
2结果与分析
2.1油茶三萜皂苷分离纯化流程图
本研究以油茶三萜皂苷粗品为原料，分别经过AB-8大孔树脂初步纯化、硅胶（100-200目）分离纯化、硅胶（200-300目）二次分离纯化、ODS-C18OPN分离纯化、ODS-C18OPN二次分离纯化、HPLC分离纯化后得到油茶三萜皂苷单体组分。
2.2AB-8大孔树脂纯化油茶三萜皂苷
油茶三萜皂苷粗品900g，经过AB-8大孔树脂初步纯化后得到149g样品，其得率为16.6%。
图1中A组为AB-8大孔树脂纯化前的样品，B组为纯化后，图左侧为TCL分析，点板显色中可明显看出B组中没有A组标号为1、2、4处的杂质显色反应，而两组中所共有的3号则主要表示油茶三萜皂苷的显色反应。
右侧为液相分析图谱，相较于A组，B组中10min之前的杂峰明显减少，说明部分杂质被除去。
TCL分析和液相分析说明AB-8大孔树脂吸附法能够有效地去除油茶三萜皂苷粗品中的部分杂质。
图1TLC和HPLC分析
Fig.1TLCandHPLCanalysis
2.3硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷
样品A经硅胶（100-200目）分离纯化后共得30个组分，从中选出质地均匀、颜色较浅的组分点板显色，经点板显色分析后选出每根柱子的2号组分（共22g）通过硅胶（200-300目）进行二次分离纯化，共得到17个组分（共19.419g），见表2。
两次硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷后的最终得率为64.73%。
表2硅胶二次分离纯化后所得组分（单位/g）
Table2Componentsobtainedafterthesecondarypurificatedbysilicagel（units/g）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
合计
柱1
柱2
0.2763
0.7098
2.0105
4.2434
1.446
3.6401
2.524
1.3334
1.8297
0.443
0.3429
0.1755
0.0848
0.2234
0.0573
0.0628
0.0161
8.5876
10.8314
将经硅胶（100-200目）分离纯化与硅胶（200-300目）二次分离纯化后的对应组分进行液相分析，由图2可见，经硅胶二次分离纯化的组分在10min之前的杂峰明显减少，说明硅胶二次分离纯化油茶三萜皂苷可进一步除去部分杂质。
硅胶（100-200目）分离纯化
硅胶（200-300目）二次分离纯化
图2液相分析对比图
Fig.2Analysisofliquidphasecomparisonchart
2.4ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷
选择液相图相似的组分合并进行ODS-C18OPN分离纯化后得到25个组分，见表3。
五组样品上样前共19.419g，经ODS-C18OPN分离纯化后所得样品总量为9.7579g，得率为50.25%，流失较多，主要原因有：
样品经滤膜和有机膜过滤时有损失；ODS-C18OPN柱中仍含有部分样品；转移称重时有损耗等。
表3ODS-C18OPN柱分离纯化后所得组分（单位/g）
Table3ComponentspurifiedandseparatedbyODS-C18OPNcolumn（units/g）
上样次数
洗脱梯度
50%
60%
65%
70%
100%
合计
第一次
第二次
第三次
第四次
第五次
0.0471
0.0312
0.0623
0.6903
0.0219
0.0895
0.0918
0.0633
0.3481
0.0535
0.5056
0.1277
0.4606
0.1696
0.0248
0.5238
0.8797
0.5553
0.6901
0.0565
0.6462
0.0526
0.9031
2.1241
0.5392
1.8122
1.183
2.0446
4.0222
0.6959
9.7579
ODS-C18OPN二次分离纯化后得到三组较纯的油茶三萜皂苷组分（共1.6159g），60%甲醇洗脱的流出液全部收集为一组；65%甲醇洗脱后分3组收集，每组200ml；100%甲醇洗脱后先收200ml,剩余流出液合为一组，共得出6个组分，得率为67.64%。
根据液相分析图，从两次ODS-C18OPN分离纯化所得的组分中挑选出单峰明星的组分，便于后期的单峰分离。
表4ODS-C18OPN二次分离纯化后所得组分（单位/g）
Table4Comp
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