食品微生物实验备课笔记.docx

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食品微生物实验备课笔记

食品微生物实验

备课笔记

吴君艳

江苏食品职业技术学院

2012年8月

实验一普通的光学显微镜的构造和使用（2课时）

一、目的要求

1、了解显微镜的构造、性能及原理

2、掌握显微镜的基本使用技术和保养方法

3、掌握显微镜（油浸镜）观察、识别细菌基本形态的方法

二、实验器材

菌种：

霉菌标片、大肠杆菌染色标本片、金黄色葡萄球菌标本片

试剂：

香柏油、二甲苯

仪器及其他：

显微镜、擦镜纸

三、方法与步骤

1、低倍镜观察

先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

2、高倍镜观察

　　显微镜的设计一般是共焦点的。

低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。

3、油浸镜观察

　油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。

使用油镜按下列步骤操作：

（1）先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。

（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

（3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。

（4）从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈，使光线充分照明。

用粗调节旋钮将载物台徐徐下降，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。

如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。

（5）观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。

4、结束后，将显微镜各处擦拭干净，套上镜罩后方可离开。

四绘图说明根霉菌标准片中观察到的细菌的形态特征。

五、思考题

1、油镜完毕后，镜头应如何处理?

2、什么叫工作距离？

实验二酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定（2课时）

一、实验目的

1、进一步熟练掌握显微镜的使用技术，通过高倍镜观察了解酵母菌的形态结构。

2、掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。

二、实验器材

1、菌种：

酵母菌标准片，酵母菌菌悬液。

2、染色液或试剂：

革兰氏染色用碘液，0.1％吕氏碱性美兰染色液

3、仪器和其他：

显微镜、载玻片，盖玻片、镊子

三、方法与步骤

1、酵母细胞的形态观察

（1）酵母菌水-碘液浸片的制作：

取一洁净的载玻片，用滴管取一小滴革兰氏染色用碘液，将其滴于载波片中央，然后滴加酵母菌悬液放入其中混匀，盖上盖玻片，小心将其一端与菌液接触，然后缓慢放下，避免产生气泡。

（2）镜检：

先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。

用同样的方法观察其他酵母菌标本片。

观察是注意酵母菌细胞的形状和出芽情况。

2、死活酵母细胞的染色鉴别

取美兰染色液一滴，滴在载玻片中央，再加一滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3～5min后加盖玻片镜检。

未被染色的是活细胞，被染成蓝色的是死细胞。

四、绘图说明所观察到的酵母菌的形态特征。

五、思考题

1、如何鉴别死活酵母菌？

实验三酵母菌细胞数的测定（2课时）

一、目的要求：

了解血球计数板测定微生物数量的原理。

了解血球计数板的结构，学习并掌握利用血球计数板进行酵母菌记数的方法，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。

二、实验原理

微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。

前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值。

后者是在平板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。

三、实验器材

菌种酵母菌液

仪器显微镜，血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸等

四、操作方法

酵母细胞数的测定操作方法

1.血球计数板的构造

血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。

玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。

方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。

计数室通常有两种规格。

一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。

（本实验用）

2、酵母菌菌数量的测定

（1）取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。

（2）将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。

也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

（3）静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

（4）计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格（即100小格）的酵母菌数。

如果是25中格计数板。

除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数（即80小格）。

由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。

如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

（5）凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。

每个样品重复分数2-3次（每次数值不应招差过大，否则应重新操作），取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。

每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数

（6）血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。

洗净后自行晾干或吹风机吹干。

四、实验报告

将实验结果填入下列表格

 计数次数

每个大方格菌数

稀释

倍数

总菌数

平均值

1

2

3

4

5

 第一次

 第二次

五、思考题

根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?

应如何尽量减少？

实验四酵母菌大小的测定（2课时）

一、目的要求：

了解测量微生物大小的原理，掌握酵母菌大小的测定技术。

二、实验原理

先用绝对长度的物镜测微尺（即镜台测微尺）来校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度，然后放上待测的标本，用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数，就可计算该微生物的大小。

三、实验器材

菌种酵母菌液

仪器显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、滴管、擦镜纸等

四、操作方法

1.测微尺的构造和使用方法

（1）目镜测微尺的构造目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确的刻度，用前必须用物镜测微尺来标定。

（2）物镜测微尺的构造物镜测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。

圆圈内刻有分度。

2.目镜测微尺的标定

（1）取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放入接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。

（2）将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。

（3）先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。

3.计算方式

因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度（即目镜校正值）。

（1）目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10／两个重叠刻度间目镜测微尺格数。

例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm

（2）以同样方法，分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度。

目镜测微尺（）格=物镜测微尺（）格

目镜测微尺每格=（）

（3）如此测定后的目镜测微尺的尺度，仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数。

若更换物镜、目镜的放大倍数时，必须再进行校正标定。

4.酵母菌大小的测定

（1）取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。

（2）移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。

测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。

一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。

而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。

四、实验报告

将实验结果填入下列表格

表1目镜测微目尺校正结果

物镜      目尺格数       台尺格数       目尺校正值（μm）

4×

10×

40×

表2 酵母菌大小测定记录 （格）

  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值

长

宽

结果计算 长μm＝平均格数×校正值

宽μm＝平均格数×校正值

大小表示：

长μm×宽μm

五、思考题

目镜测微尺在用前为什么要校正？

实验五霉菌的形态观察（2课时）

一、目的要求

了解霉菌的标本制作方法，观察根霉、毛霉、青霉、曲霉的形态结构

二、实验原理

霉菌的形态及结构

霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构成，菌丝分为基内菌丝、气生菌丝，气生菌丝特化结构上产生多种无性、有性孢子，孢子着生部位、排列方式以及孢子形态可作为真菌鉴定的重要依据。

菌丝特化形成假根等特化菌丝。

霉菌由于菌丝粗大，细胞易收缩变形，且孢子易飞散，制片时常用乳酸石炭酸棉蓝染液，它一方面杀菌防腐，保持细胞不变形，另一方面有染色作用。

三、实验器材

菌种根霉、毛霉、青霉、曲霉标本片

仪器显微镜、擦镜纸

四、操作方法

1、先将低倍物镜的位置固定好，然后放置霉菌根霉标本片，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察，注意观察根霉假根的形态，并绘出根霉形态图。

2、依次观察毛霉、青霉、曲霉、根霉标本片，绘制各种霉菌的形态图，并标明看到的各部位的名称。

五、实验报告

毛霉曲霉

放大倍数__×____放大倍数__×____

青霉根霉

放大倍数__×____放大倍数__×____

六、思考题

1、霉菌对人类生活和生产能产生哪些积极作用和消极作用？

实验六玻璃器皿的清洗包扎及高压蒸汽灭菌（4课时）

一、目的要求

1、了解高压蒸汽灭菌的基本原理。

2、学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。

本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。

通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。

蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

高压蒸汽灭菌法：

高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。

这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。

当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。

一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

干热灭菌法：

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。

一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。

火焰灭菌：

直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。

对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。

此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。

三、实验器材

1、器皿：

平皿（10个/组），1ml吸管（9支/组），试管18×180（10支/组），试管（15×150）（12/组），三角锥瓶500ml（3个/组）、三角锥瓶500ml（内装蒸馏水250ml），10ml吸管

2、其他：

牛皮纸或报纸，酒精灯，棉花，高压蒸汽菌锅，电烘箱，线绳,毛刷等

四、操作方法

（一）、玻璃器皿的清洗包扎

玻璃器皿在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。

1、将平皿用纸包扎好，以5～8个为一包；

2、吸管应在管口约0.5厘米以下的地方塞入少许长约1.5厘米的棉花，以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，松紧程度以吹气时通气顺畅而不致下滑为准，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去。

然后，将吸管尖端放在4-5厘米宽的长条纸的一端约与纸条成45°角，折叠纸条，包住吸管尖端，然后将吸管卷入纸条内，末端剩余纸条折叠打结，待灭菌。

，

3、三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；

4、试管塞上棉花塞，多支扎成一捆外用牛皮纸或两层旧报纸与细线包扎好。

（二）、干热灭菌

将包扎好的试管、平皿、三角锥瓶放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。

将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。

如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。

温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。

（三）、高压蒸汽灭菌

1、加水：

打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。

立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。

注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

2、装料、加盖：

将待灭菌物品放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。

3、排气：

打开排气口（也叫放气阀）。

用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。

4、升压、保压和降压：

当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。

当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。

注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

五、思考题：

1、吸管在灭菌前应如何处理？

2、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？

灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？

实验七培养基的制备（4课时）

一、目的要求

1、了解并掌握培养基的配制、分装方法。

2、学习微生物实验的一些准备方法（灭菌培养皿的准备、灭菌吸管的准备、无菌水的准备、培养基平板和斜面的准备等），为后续实验做准备。

二、实验原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。

另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。

加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。

但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。

一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

三、实验器材

试剂：

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、乳糖、K2HPO4、猪胆盐、2％伊红Y溶液，0.65％美兰溶液，0.04％溴甲酚紫水溶液、15%NaOH溶液、5%HCl溶液。

器皿及材料：

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸（7.2-7.4）、量筒（500ml、1000ml）、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶（500ml）、漏斗、分装架、移液管（2ml）、平皿、玻璃棒、烧杯、试管架、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱，杜氏小管等

四、操作方法

1、培养基的制备

营养琼脂培养基（每班最多1500ml）

（1）配方：

牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15—20g

蒸馏水1000mlpH7.2—7.4

（2）制法：

将称好的牛肉膏、蛋白胨及NaCl放入搪瓷缸中，加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，再加入15％氢氧化钠2ml，校正pH7.2－7.4，然后，在石棉网上加热使其溶解。

将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。

最后补足所失的水分。

（3）分装：

取玻璃漏斗一个，放在铁架台上，将培养基分装进试管（18×180），其装量不超过管高的1/5，分装三角瓶的量不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

（4）加塞：

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

（5）包扎：

加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

（6）灭菌：

一般培养基是在1.05㎏/㎝2（15磅/英寸2），121.3℃，15-30分钟高压蒸汽灭菌。

（7）搁置斜面：

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

伊红美蓝培养基（EMB培养基）（每班500ml）

（1）配方：

蛋白胨10g乳糖10gK2HPO42g琼脂17g2%伊红水溶液20ml

0.65％美蓝水溶液10ml蒸馏水1000mlpH7.1

（2）制法：

将称好的蛋白胨、乳糖及K2HPO4放入搪瓷缸中，加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，再加入15％氢氧化钠校正pH7.1。

（3）分装：

取玻璃漏斗一个，放在铁架台上，将培养基分装进分装进三角瓶，量不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

（4）包扎，同上

（5）灭菌，同上

乳糖胆盐发酵管（每班1000ml）

蛋白胨20g猪胆盐5g乳糖10g0.04％溴甲酚紫水溶液25ml

蒸馏水1000mlpH7.4

（2）制法：

将称好的蛋白胨、乳糖及猪胆盐放入搪瓷缸中，加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，再加入15％氢氧化钠校正pH7.1，再加入指示剂。

（3）过滤和分装：

取玻璃漏斗一个，在玻璃漏斗中放一层滤纸，放在铁架台上，将培养基分装进试管，每管10ml，并放入小倒管。

（4）包扎，同上

（5）灭菌，同上

2、无菌检查　将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

五、实验报告

1、微生物的培养基应具备哪些条件？

为什么？

2、制备培养基的一般程序是什么？

3、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？

如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

实验八微生物的分离、接种和培养技术（4课时）

一、目的要求

1、了解微生物分离和纯化的原理，掌握常用的分离纯化微生物的方法

2、学习掌握微生物的接种技术，建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。

二、实验原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。

接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。

无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。

接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。

三、实验器材

培养基：

营养琼脂培养基，伊红美蓝培养基

器皿：

培养皿，接种环，酒精灯，玻璃涂棒，显微镜

四、操作方法

1、倒平板：

将已经制备好的营养琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时倒入灭过菌的培养皿中。

2、涂布：

在上述培养基中用无菌吸管吸取湖水的稀释液0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

3、培养：

上述培养基平板倒置于37℃温室中培养24h。

4、伊红美蓝培养基准备：

在已经制备好的伊红美蓝培养基中加入乳糖，加热溶化琼脂，冷却至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板；

5、分离：

将培养后长出的单个菌落挑取少许细胞，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在伊红美蓝培养基上将少许细胞先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀，置37℃温室培养24h。

6、接种：

操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行。

先点燃酒精灯，右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。

镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。

用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。

棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。

用灼烧灭菌的接种环从伊红美蓝培养基上挑取分离的单个大肠杆菌菌落，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从平板上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。

在试管中由下往上做S形划线。

接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。

再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。

将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。

五、思考题

1、倒平板时要注意哪些问题？

2、接种有哪几种常用的接种方法？

固体斜面接种时要注意什么？

实验九细菌的简单染色和革兰氏染色（4课时）

一、目的要求

1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。

2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。

二、实验原理

细菌的菌体很小，活细胞的含水量在80％～90％，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。

根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。

本实验只学习前两种。

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。