高效大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子Word下载.doc

高效大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子Word下载.doc

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预期应用：

ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中GM-CSF含量。

说明

l试剂盒保存：

-20℃（较长时间不用时）；

2-8℃（频繁使用时）。

l浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

l中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

l刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗GM-CSF抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗GM-CSF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的GM-CSF呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.酶联板（Assayplate）：

一块（96孔）。

2.标准品（Standard）：

2瓶（冻干品）。

3.样品稀释液（SampleDiluent）：

1×

20ml/瓶。

4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibodyDiluent）：

1×

10ml/瓶。

5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidinDiluent）：

1×

6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：

1×

120μl/瓶（1：

100）。

7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：

1×

8.底物溶液（TMBSubstrate）：

9.浓洗涤液（WashBuffer）：

1×

20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.终止液（StopSolution）：

1×

10ml/瓶（2NH2SO4）。

需要而未提供的试剂和器材

1.标准规格酶标仪

2.高速离心机

3.电热恒温培养箱

4.干净的试管和Eppendof管

5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器

6. 蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1.血清：

全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：

可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°

C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.细胞培养物上清或其它生物标本：

1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：

标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。

只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。

稀释的过程中，应做好详细的记录。

最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

标准品的稀释原则：

2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100pg/ml,，做系列倍比稀释后，分别稀释100pg/ml,50pg/ml,25pg/ml,12.5pg/ml,6.25pg/ml,3.12pg/ml,1.56pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前15分钟内配制。

如配制50pg/ml标准品：

取0.5ml（不要少于0.5ml）100pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

生物素标记抗体的稀释原则：

临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：

临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

每次检测都应该做标准曲线。

如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.加样：

分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。

每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

在加终止液后15分钟以内进行检测。

实验备注

l用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

l每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。

测量时先用此孔调OD值至零。

l为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

l未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。

标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。

请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

l建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法

手工洗板方法：

吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；

在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；

将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。

根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：

如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；

再乘以稀释倍数；

或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

l底物请避光保存。

l当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

l请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

l洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

l不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

l一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

l在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

l如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。