体内间充质干细胞自我更新分化及其调控相关组织干细胞的机制研究.docx

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体内间充质干细胞自我更新分化及其调控相关组织干细胞的机制研究

项目名称：

体内间充质干细胞自我更新、分化及其

调控相关组织干细胞的机制研究

首席科学家：

李保界上海交通大学

起止年限：

2012.1至2016.8

依托部门：

上海市科委

一、关键科学问题及研究内容

拟解决的关键科学问题

基于MSC广谱的疾病治疗应用前景，针对目前对MSC的微环境、自我更新、

分化机理等缺乏系统研究的现状,本课题拟解决以下关键科学问题:

1.通过建立脂肪细胞、成骨细胞、骨髓HSC缺乏及血管再生受阻的动物模型，探讨这几种细胞是否作为骨髓MSC的微环境调节MSC的干性维持、自我更新与分化，寻找这些细胞旁分泌的活性分子在其中的作用，并探讨这些活性分子在抵抗组织衰老、促进组织再生与损伤修复中的作用。

2.通过在体研究PTHrP-Bmi1BMP-MAPKp16和p53通路等在调控MSC自我更新与分化中的作用机制，阐释MSC自我更新与分化的关键信号分子在抵抗组织衰老，促进组织再生及损伤修复中的作用，并与微环境中的信号分子建立联系。

3.通过系统地分析MSC自我更新、分化过程中表观遗传学的改变，寻找受DNA甲基化、组蛋白修饰、non-codingRNA调控的目标基因。

结合基因表达图谱，阐释在MSC的维持、自我更新及分化中的新表观遗传学基础。

利用基因敲除小鼠，研究若干关键表观遗传调控基因在MSC自我更新与分化中的作用及机制，并研究其与信号通路的关系。

4.通过对骨折愈合、HSC造血和神经损伤修复的在体研究，阐释MSC及其分化细胞在这些过程中的作用和机制，以期为MSC的临床应用提供理论依据和指导。

探讨两种活性分子通过促进MSC增殖及向成骨细胞分化，加速骨形成和骨折愈合以及促进HSC造血和神经再生与修复的应用前景。

主要研究内容

1.建立可识别和分离体内骨髓MSC的基因工程小鼠体系

拟建立Gt（ROSA）26Sor-YF；PNestin-Cre小鼠、Gt（ROSA）26Sor-YF；PPrxI-Cre

小鼠、Gt（ROSA）26Sor-YFPDermo-Cre小鼠，用于观察体内MSC的状况以及通过流式分选这些细胞。

2.建立可特异性杀死MSC成骨细胞或者其他细胞的基因工程小鼠体系

利用细胞特异性的CreER（T和iDTR小鼠，注射白喉毒素特异性杀死Cre表达的细胞。

3.MSC的骨髓微环境中的细胞成分和活性分子鉴定

特异性地的杀死脂肪细胞/成骨细胞，利用生物活性分子促进HSC从骨髓迁徙到外周血或者抑制血管再生，观察其对MSC增殖和分化的影响；建立并利用细胞共培养体系探讨脂肪细胞、成骨细胞、血管内皮细胞及HSC对MSC的自我更新和分化的影响。

利用液体芯片技术分析脂肪细胞、血管内皮细胞、

HSC以及成骨细胞所分泌的生长因子及活性分子，并研究它们对体内MSC

的调控作用。

4.MSC在组织再生与损伤修复中的作用

特异性杀死MSC或成骨细胞，比较MSC和成骨细胞作为造血微环境在改善

HSC造血中的作用，并探讨BMPRIA和TGF受体特异敲除对HSC造血的影响；研究MSC的减少或缺失对SSRIs（抗抑郁症药物）引起的NSC神经元分化的可能作用；研究MSC的减少或缺失对LPS引起神经损伤修复的影响。

5.MSC自我更新与定向分化的信号调控机制

研究Bmi1在MSC增殖、分化以及衰老中的作用；研究p53和p16在Bmi1引起的MSC衰老及分化中的作用以及与过氧化物的关系；研究BMP-BMPRIA-MAPK在调节MSC增殖和分化中的作用及分子机理。

6.MSC自我更新与分化的表观遗传学调控

利用基因敲除小鼠，研究表观遗传关键调控基因在MSC自我更新与分化中

的作用及机制；确立在MSC自我更新与分化过程中被表观遗传修饰的靶基因谱以及与上述关键调控基因的关系；搜寻MSC自我更新与分化过程中新

的IncRNA和microRNA分子，并阐释其调控成骨分化的功能；建立调控MSC自我更新与分化的表观遗传网络，并与其信号调控网络和基因表达图谱建立联系。

7.筛选可调节体内MSC更新、定向分化以及促进组织损伤修复的活性分子

改造BMP蛋白分子以及筛选BMPs的小分子激动剂，在体研究BMPs激动剂在体内MSC自我更新、分化、骨再生/骨折愈合以及造血和神经损伤修复

中的作用；探讨BMP是否通过MSC或成骨细胞促进造血

二、预期目标

总体目标：

利用多种动物模型，通过研究正常生理状况下、衰老、骨折愈合、造血、神

经损伤修复过程中MSC的活动与功能，在理论方面，阐释MSC的维持、自我更新、分化的调控机制，深入地了解MSC的生物学本质；在应用方面，探讨活性蛋白或小分子化合物通过调节MSC的增殖与分化，在促进骨再生、HSC造血和神经再生修复中的应用，为MSC广泛的临床应用提供坚实的实验依据。

最终促使我国在MSC相关领域形成自己的特色，达到国际领先水平。

同时，以本项目为纽带，促进多学科、多院校的合作和交流，培养一批优秀的干细胞研究人才。

五年预期目标：

1•禾U用本团队已建立的小鼠模型，通过降低骨髓HSC成骨细胞或者脂肪细胞的数量以及抑制血管再生，研究MSC骨髓微环境中起作用的细胞组成，并禾用体外共培养的方法，研究这些细胞分泌的因子对MSC增殖与分化的调控作用以及机制。

以骨骼代谢的重要调节分子BMPs入手，阐释BMPs在MSC的维持、自我更新以及衰老中的作用。

2．禾用Bmi1、p53、p16、p38、Tak1等基因敲除小鼠模型，研究MSC体内自我更新与分化的信号通路调控。

揭示MSC自我更新信号的主要调节机制，以及协调MSC分化为成骨或者脂肪细胞的信号调节机制。

在此基础上，寻找延迟MSC衰老、抑制MSC脂肪分化、促进其成骨分化的关键信号分子，为延缓骨骼衰老、促进骨再生及损伤修复提供理论基础。

3•通过研究分离出的MSC培养的MSG以及分化出的成骨细胞、脂肪细胞

MSC

等的表观遗传学差异，和相应细胞的基因表达图谱进行比较，阐释调控

的维持、增殖及分化为不同细胞的表观遗传学机制，寻找在此过程中起重要作用的新调节基因。

从而通过控制基因表达延缓MSC衰老，促进其增殖及向成骨分化。

4•探讨内源性MSC及其分化的细胞对HSG神经损伤修复的作用。

研究在此过程中正常或者BMP/TGB信号受阻的MSC和成骨细胞等对HSC微环境的贡献以及对神经损伤修复的作用。

改造BMP蛋白分子以及筛选BMPs的小分子激动剂，研究它们对体内MSC的维持、自我更新和分化、以及HSC造血、骨及神经再生与修复中的作用。

5．取得具有国际影响的原创性成果,预期在国内外专业期刊上发表一批高水平论文。

其中在国际一流学术刊物（IF>10）上发表论文10篇以上，在有影响力的杂志（IF>5）上发表论文50篇以上。

另外，申请专利5项以上。

6．预计培养博士后25-35人，博士研究生50-80人及一批学术水平高、创新能力强的中青年学术骨干,为MSC研究打造一支具有国际影响力的高水平研究

队伍

三、研究方案学术思路：

间充质干细胞作为研究最活跃的成体干细胞，在骨骼的发育与再生中起重要的作用，同时还具有其它干细胞不具有的广阔的应用前景。

目前，对MSC的稳

态维持、自我更新与分化的调控机制知之甚少，因此无法精细地控制MSC的活

动与功能，以达到预期的治疗效果，严重阻碍了MSC的临床应用。

此外，人们尚不清楚骨骼以外的修复功能是否也是内源性MSC固有的。

在综合本团队及国内外的最新研究进展的基础上，我们将以MSC的微环境、体内自我更新与分化的遗传和表观遗传学机制、MSC支持其它组织（造血和神经）再生与修复的机制为研究主线，以多种基因敲除小鼠为工具，对正常及病理状态下调控MSC命运

的关键环节特别是关键分子靶点及信号网络进行系统的研究。

通过以上几个方面的系统研究，我们将对MSC的体内自我更新与分化有一个全面的了解，从而指导MSC的临床应用。

探讨活性蛋白PTH改变骨髓微环境中的MSC成骨分化促进造血的机制和应用，通过对重组BMP以及BMP小分子激动剂的筛选，寻找可通过调节MSC自我更新与定向分化，对抗骨质疏松、促进骨折愈合以及其它组织修复的小分子药物，提升中国药物研发的能力，创造具有自主知识产权的、具有国际竞争力的新技术、新产品，服务于我国经济发展与人民健康。

创新点与特色

1.首次利用多种基因工程小鼠（团队拥有几十种基因工程小鼠的资源）对MSC

的微环境中各类细胞进行系统的分析；并通过液体芯片技术对这些细胞所分

泌的活性生物分子进行系统而全面的分析以及功能验证，对骨髓MSC的微

环境提供一个全面的认识。

本项目研究的是科学前沿问题、具体目标明确，有很强的创新性。

2.利用Prx1-CreERf和Dermo-Cre转基因小鼠和iDTR小鼠，在注射小鼠白喉毒素的情况下，特异的杀死体内的MSC,研究内源的MSC在骨折愈合、造血以及神经损伤修复中的作用。

该研究对MSC的临床应用具有重要的意义。

这有别于以往的MSC的局部注射或者静脉注射，所用的MSC未经过体外扩增，因此可以探讨MSC真正的体内功能。

3.率先利用MSC特异性Bmi1或Sirt1高表达，研究它们是否能够通过促进MSC自我更新和向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥抗骨质疏

松作用；率先揭示PTHrP经Bmi1介导抑制p53和p16通路活性，抑制氧化应激反应，刺激BM-MSC自我更新，促进其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥抗衰老和抗骨质疏松的作用机制。

4.率先研究若干关键表观遗传调控基因在MSC自我更新与分化中的作用及其机制分析；确立在MSC分化过程中被表观遗传修饰的靶基因谱及搜寻新的lncRNA和microRNA分子并阐释其调控成骨分化的功能。

5.本项目对贯穿于四个课题的骨形态蛋白进行了较为全面的研究，筛选可以替代BMPs的小分子激动剂，并取得了很大的进展，将为骨质疏松以及骨损伤修复的治疗提供一种新的途径。

6.参加人员已在相关领域取得国际认可或领先的前期研究结果。

本研究课题所涉及的各个方面内容大多是前期工作基础上的延伸或拓展。

因此，本项目具

有很高的研究起点和可行性，预期结果必将在国际MSC研究领域中占领新

高地，促进我国干细胞研究整体水平和地位的进一步提升。

课题设置

课题一：

成体MSC的骨髓微环境

研究目标:

1.明确脂肪细胞、成骨细胞、HS（及血管内皮细胞是否作为骨髓MSC的微环境调节MSC勺干性维持、自我更新与分化。

2.鉴定骨髓MSC微环境的旁分泌活性分子在调节MSC勺干性维持、自我更新与分化中的作用。

3.明确BMPs是否作为MSC微环境中的重要活性因子。

研究内容:

1.利用脂肪特异的Adipoq-CreER（T（）Cre和tamoxifen-responsiveestrogen

receptor）；iDTR小鼠（2个月和12个月），注射白喉毒素特异性杀死脂肪细胞，观察脂肪细胞缺乏对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。

2.利用Osx-CreER（T）iDTR小鼠（2个月和12个月），特异性杀死成骨细胞，观察成骨细胞缺乏对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。

3.利用生物活性分子促进HSC从骨髓迁徙到外周血，观察HSC缺乏对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。

4.利用bevacizumab和carboxyamidotriazole抑制血管再生，观察血管再生损伤对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。

5.

HSC

建立并利用细胞共培养体系探讨脂肪细胞、成骨细胞、血管内皮细胞及

对MSC的自我更新和分化的影响。

利用液体芯片技术（Bio-Plex系统）分析

脂肪细胞、血管内皮细胞、HSC以及成骨细胞所分泌的生长因子及活性分子，并研究它们对体内MSC的调控作用。

6.研究微环境中活性分子在年轻和衰老小鼠的MSC更新与分化中的作用经费比例：

30%

承担单位：

上海交通大学

课题负责人：

李保界

学术骨干：

李旌、贾德永、乐黄莺

课题二：

MSC自我更新与分化的信号调控机制

研究目标:

1.明确Bmi-1在调节BM-MSC自我更新和分化中的作用及机制。

2.明确p53和p16通路在PTHrP和Bmi-1调节BM-MSC自我更新和分化中的作用及机制。

3.明确Bmi1是否通过抑制氧化应激反应，刺激BM-MSC自我更新，促进其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥在抗衰老和骨质疏松中的作

用。

4.明确BMP-MAPK信号通路在MSC自我更新、衰老、成骨细胞的定向分化中的作用机制。

研究内容：

1.通过在Bmi1缺失小鼠MSC特异性高表达Bmi1或Sirtl，研究MSC特异性高表达Bmi1或Sirtl能否通过促进BM-MSC自我更新，诱导其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化，而纠正Bmi1基因敲除引起的成熟前骨质疏松的表型。

2.通过在PTHrPK或Bmi1-/-小鼠敲除p53或p16基因，经表型差异分析，研究53和p16通路在PTHrP-Bmi1调节BM-MSC自我更新和分化中的作用及机制。

3.通过饮水中添加抗氧化剂NAC喂养Bmi1-/-小鼠，研究Bmi1是否经过抑制氧化应激反应，刺激BM-MSC自我更新，促进其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥它们在抗衰老和骨质疏松中的作用。

4.将利用MSC特异性敲除Tak1或p38MAPK小鼠模型，研究BMP-MAPK通路在调节MSC增殖和分化中的相互作用及分子机理。

5.以上通路与课题一鉴定的微环境中信号分子的联系。

经费比例：

22.5%

承担单位：

南京医科大学、中国科学院深圳先进技术研究院、同济大学

课题负责人：

苗登顺

学术骨干：

陈宁、杨帆、张磊

课题三：

MSC自我更新与分化的表观遗传学调控

研究目标:

1.验证若干表观遗传关键调控基因在MSC自我更新与分化中的作用及其机制

2.确立在MSC自我更新与分化过程中被表观遗传修饰的靶基因谱，包括DNA甲基化模式和组蛋白修饰模式等，并研究其与

（1）关键基因的关系。

3.搜寻MSC自我更新与分化过程中新的IncRNA和microRNA分子，并阐释其调控成骨分化的功能。

4.建立调控MSC自我更新与分化的表观遗传网络，并与其信号调控网络和基因

表达图谱建立联系。

研究内容:

1.利用DNA加氧酶1-3,methylCpG结合蛋白Mbd5,PcG复合物组分MPc2及

Chromobox蛋白Cbx6等基因敲除小鼠，研究这些表观遗传关键调控基因在

MSC自我更新与分化中的作用及机制。

2.确立在MSC自我更新与分化过程中被表观遗传修饰的靶基因谱，包括DNA甲基化模式和组蛋白修饰模式等，以及与上述关键调控基因的关系。

3.搜寻MSC自我更新与分化过程中新的lncRNA和microRNA分子，并阐释其调控成骨分化的功能。

4.建立调控MSC自我更新与分化的表观遗传网络，并与其信号调控网络和基因

表达图谱建立联系。

经费比例：

22.5%

承担单位：

中国科学院上海生命科学研究院、同济大学、上海交通大学

课题负责人：

徐国良

学术骨干：

郭熙志、刘海亮、李明发

课题四：

MSC在组织（造血、神经）再生以及损伤修复中的作用

研究目标：

1.明确MSC成骨细胞、及其BMP/TGF信号通路是否作为微环境改善HSC的造血。

2.明确PTH能否通过调节MSC及其分化的成骨细胞，改善造血微环境，激活

Notch通路，发挥纠正Bmi1缺失引起的造血障碍。

3.利用基因工程小鼠模型，明确内源性MSC在神经组织再生以及损伤修复中的

作用

4.明确BMP小分子激动剂在骨/HSC造血/神经再生与修复中的作用。

研究内容：

1.利用Prxl-CreER（T）iDTROsx-CreER（T）iDTR小鼠，特异性杀死MSC或成骨细胞，比较MSC和成骨细胞作为造血微环境在改善HSC造血中的作用；利用Prx1-CreER（T）以及Dermo-Cre小鼠特异敲除BMPRIA和TGF受体，研究MSC中这两个通路对HSC造血的影响。

2.通过PTH给药，研究其能否通过改善造血微环境，抑制氧化应激，激活Notch

通路，发挥纠正Bmi1缺失引起的造血障碍的作用。

并利用Prx1-CreER（T））

iDTROsx-CreER（T）iDTR小鼠验证这两种细胞对PTH促造血的影响。

3.利用Prx1-CreER（T）;iDT小鼠以及Dermo-Cre;iDTR小、鼠研究MSC的减少或缺失对SSRIs（看抑郁症药物）引起的NSC神经元分化的可能作用；我们将利用Prx1-CreER（T）;iDT小鼠以及Dermo-Cre;iDTF、、鼠研究MSC的减少或缺失对LPS引起神经损伤修复的影响。

4.改造BMP蛋白分子以及筛选BMPs的小分子激动剂，利用2个月和12个月小鼠，研究BMPs激动剂在体内MSC自我更新、分化、骨再生/骨折愈合以及造血和神经损伤修复中的作用。

经费比例：

25%

承担单位：

同济大学、中国人民解放军军事医学科学院

课题负责人：

孙奋勇学术骨干：

刘兵、张玲、杨冠

各课题间相互关系

体内MSC的自我也新与分化

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MSC维捋、II我史新

定向分化

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I期丈柞为融坤境调节兀他I细胞的机制妙窕J

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人类健康

基于拟解决的关键科学问题，结合国内外最新研究进展以及研究团队的大量

前期工作，本项目设置4个课题：

1、MSC的骨髓微环境；2.MSC自我更新与分化的信号调控机制；3、MSC自我更新与分化的表观遗传学调控；4.MSC在组织再生与修复中的作用。

本项目的四个课题围绕MSC的体内自我更新、定向分化以及组织修复功能的体内外调控机制这一关键科学问题进行研究，各课题组既有

相对独立的明确的研究方向，又有密切的联系。

而且课题组成员已在上述领域进行了长期的原创性研究，相互间已有多年合作研究的基础。

课题一、二、三围绕调节MSC的体内外信号、基因表达以及表观遗传学的

调控，旨在阐明体内MSC的维持、自我更新与分化的整体调控网络。

课题四研

究MSC在几种组织的再生（生理状态）以及损伤修复（病理状态下）中的作用及其作用机制，为MSC在再生医学中的应用提供理论依据。

该课题不仅是课题一〜三基础研究的补充，而且满足国家转化医学相关的重大需求，体现本课题的临床应用价值以及潜在的经济效益。

课题一至三，共同为课题四提供理论基础和实验依据，而课题四是在其它课题研究基础上，将研究成果服务于延缓骨衰老、促进骨再生以及其它组织再生与修复的整体目标，为课题一至三提供调控临床应用的最终落脚点。

四、年度计划

研究内容

预期目标

第

年

基因工程小鼠的建立：

包括多种Cre;iDTR小鼠可在体杀死CRE特异表达的细胞。

基因工程小鼠的建立：

包括多种Cre；Gt（ROSA）26Sor-YFP可用于观察体内MSC,也可流式分选这些细胞。

构建MSC特异性Bmi1或Sirtl高表达转基因小鼠模型，并分别与Bmi1-/-小鼠交配。

在PTHrPK和Bmi1-/-小鼠中敲除p53以及p16基因。

建立MSC特异性敲除Tak1、p38MAPK、BMPRIA和TGF受体的小鼠模型。

利用右干重要表观遗传调控基因敲除小鼠，研究这些基因缺失对骨代谢的影响。

研究MSC更新和成骨分化中ncRNA

表达图谱的改变。

骨形态发生蛋白BMP的产业化研究工作。

建立基于Osterix的basal启动子以及8个Smad1重复结合位点，驱动luciferase的DNA载体，并在在MSC细胞株中稳定表达。

建立小鼠模型为进一步的研究打下基础，用于研究MSC微环境中的细胞成分、影响MSC衰老以及分化的重要信号通路以及MSC在相关组织损伤修复中的作用。

确定若干重要表观遗传调控基因是否调节骨的发育及代谢。

分析ncRNA的表达图谱，发现与MSC更新和成骨分化相关的ncRNA。

建立筛选BMP激动剂的体系。

研究内容

预期目标

第

年

利用建立的工程小鼠（2个月），研究微环境中调节MSC更新与分化的细胞成分。

通过促进小鼠（2个月）HSC从骨髓迁徙到外周血以及抑制血管再生，研究HSC缺乏以及血管再生对MSC更新和分化的影响。

利用细胞共培养体系和液体芯片技术发现微环境中细胞所分泌的可调节MSC的自我更新、分化及衰老的活性分子。

探讨BMPs对骨髓中MSC的自我更新、分化及衰老的影响。

研究Bmi和Sirtl在骨代谢中的作用。

研究p53和p16通路在PTHrP和

Bmi-1调节骨代谢中的作用。

研究BMP-MAPK通路在骨代谢中的作用。

分析右干重要表观遗传调控基因在MSC更新与分化中的作用。

发现MSC更新与成骨分化过程中启动子被表观遗传修饰的靶基因谱。

研究相关的ncRNA在MSC更新与分化中的作用

研究MSC中BMP和TGF信号对

HSC造血的调节作用。

筛选自然产物文库，进行复筛和验证。

确定在新成年小鼠中调节MSC活动

的微环境中的细胞成分。

发现微环境中细胞分泌的重要活性分子。

确定MSC中表达的Bmi在骨代谢中的作用。

确定p53和p16在MSC自然衰老以及PTHrPKI和Bmi-/-引发的早衰中的作用。

确定MSC中BMP-MAPK通路缺失对骨代谢的影响。

确定可调节MSC更新与分化的表观遗传调控基因。

建立与MSC更新和成骨分化相关的DNA甲基化图谱以及组蛋白修饰图谱。

发现重要的调节MSC的ncRNAo确定MSC调节HSC造血的新机制。

初步鉴定BMP的激动剂。

第

年

通过促进小鼠（12个月）HSC从骨髓迁徙到外周血、以及抑制血管再生，研究HSC缺乏以及血管再生对MSC更新和分化的影响。

研究微环境中活性分子在年轻和衰老小鼠的MSC更新与分化中的作用。

研究鉴定的活性分子在相应的衰老细胞中合成和分泌的状况以及在体内MSC中的激活情况。

研究Bmi和Sirt1对MSC更新与定向分化的调节作用。

研究BMP-MAPK信号通路在MSC自我更新、衰老、成骨细胞的定向分化中的作用。

明确衰老过程中MSC微环境的改变。

明确p53和p16通路在PTHrP和Bmi-1调节BM-MSC自我更新和分化中的作用及机制。

明确Bmi1是否通过抑制氧化应激反应，刺激BM-MSC自我更新，促进其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥在抗衰老和骨质疏松中的作用。

明确BMP-MAPK信号通路在MSC自我更新、衰老、成骨细胞的定向分化中的作用。

明确右干表观遗传关键调控基因在MSC自我更新与分化中的