发酵过程及优化实验.docx
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发酵过程及优化实验
发酵过程及优化实验
——产淀粉酶细菌的优化实验
淀粉酶是一类能催化淀粉糖苷键水解的酶类，作用于淀粉分子产生糊精、低聚糖及葡萄糖等多种产物。
而淀粉酶是应用最广的酶制剂之一，占全球酶工业市场份额的25%-33%。
淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。
目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物种属包括不动杆菌属、微球菌属、黄隐球酵母、盐单胞菌属、青霉菌属、类芽孢杆菌属、链霉素属、假单胞菌属和杆菌菌属等。
实验一培养基的配置、灭菌
一、实验目的
1.温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤。
2.了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。
二、实验原理
鉴别性培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。
如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。
三、材料和器材
（1）培养基：
普通培养基：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。
鉴别型培养基：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCl5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。
另一个鉴别性培养基加可溶性淀粉15g每1000ml。
（2）器皿：
电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管等。
（3）其他：
药匙，记号笔，报纸等。
（4）碘原液：
称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。
稀碘液：
取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。
四、方法和步骤
1．配制基本培养基，分装50mL至250mL锥形瓶，供实验菌株扩增。
2．配制鉴别培养基，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。
3．配制稀释用的生理盐水，分装4.5mL至每个试管（11管）。
4．包扎培养皿、锥形瓶，移液管等。
5．121℃，灭菌20min。
6．将实验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培养基上培养2天，在菌落周围滴加碘液，根据透明圈的大小，挑取合适的单菌落进行后续实验。
在加可溶性淀粉15g/L的鉴别性培养基中涂布的稀释梯度分别是10-3，10-4，10-5。
在加可溶性淀粉10g/L的鉴别性培养基中涂布的稀释梯度分别是10-5，10-6，10-7。
五、注意事项
将实验菌株涂布至鉴别性培养基表面时，掌握好稀释度，尽量获得单独的单菌落，以利于后期的筛选。
六、实验结果
1．菌落的透明圈
透明圈
2．菌落计数
淀粉浓度（g/L）
菌悬液的浓度梯度
菌落数
平均值
10
10-5
110
107
109
10-6
9
10
10
10-7
35
39
37
15
10-3
菌落太多无法计数
/
10-4
130
137
134
10-5
32
37
35
实验二生长曲线和产物形成曲线的测定
一、实验目的
1．了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。
2．学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。
二、实验原理
将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜的条件下培养，定时测定培养液中微生物的生长量（吸光度或活菌数的对数），以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线，它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。
依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。
这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培养条件而异。
因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生产实践都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种方法，如血球计数法、平板活菌计数法、称重法、比浊法等。
本实验采用比浊法来测定。
由于菌悬液的浓度与吸光值（A）也称光密度成正比，只要用分光光度计测得菌液的A后与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线，此法快捷、简便。
产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。
工业发酵的目的是为了收获产物，因此必须搞清楚产物积累最高时所需的发酵时间。
如果提前终止发酵，营养物质还没有完全被利用，发酵液中的产物量偏低；如果发酵时间过长，一方面产物可能会分解，另一方面也降低了设备利用率。
因此，学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重要的指导意义。
三、材料和器材
1．菌种
实验菌株。
2．培养基
普通培养基，鉴别性培养基。
3．器材
高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，分光光度计，摇床等。
四、方法和步骤
（一）生长曲线的测定
1.将实验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培养基上培养2天，在菌落周围滴加碘液，根据透明圈的大小，挑取合适的单菌落进行后续实验。
2.将选择的菌挑取到新鲜的基本培养基中，放置摇床上30℃，180rpm培养，过夜。
3.将第2步中培养得到的菌悬液摇匀，吸取0.5mL接入新鲜基本培养集中，30℃，180rpm培养，每隔4h取一瓶，在560nm处测吸光度，以未接种、但已灭菌的基本培养基作对照；每隔2小时取次样。
4.以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作生长曲线。
（二）产物形成曲线的测定
同上，在进行生长量测定的同时，进行产物形成量（淀粉酶活力）的测定，以培养实验为横坐标，产物形成量为纵坐标，作出产物形成曲线。
五、注意事项
1．各瓶的接种量、培养条件应一致。
2、若吸光度太高，可适当稀释后再测定。
六、结果记录
1．数据记录
培养时间/h
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
A560
0.002
0.004
0.006
0.018
0.125
0.185
0.057
0.089
0.894
0.543
2．绘制出实验菌株的生长曲线和产物形成曲线。
从标曲中，查出对应时间下吸光度值A660下的淀粉浓度，计算出酶活力。
生长曲线及淀粉酶活力图见下个实验的实验结果中。
实验三液化型淀粉酶活力的测定
一、实验目的
1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。
2．掌握在微生物分批培养时酶活力测定的基本方法。
二、实验原理
淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶，淀粉1,4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶），淀粉1,4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1,6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。
α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。
这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
三、材料与器材
1．样品
实验二中的发酵液4000rpm，5min离心得到的上清液作为粗酶液。
2．试剂
（1）碘原液：
称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。
（2）比色稀细碘液：
取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。
（3）2%可溶性淀粉：
称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，倒入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100mL。
须当天配制。
（4）pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。
（5）0.5mL/L乙酸溶液，0.85%生理盐水。
3．器材
恒温水浴锅、分管光度计。
四、方法和步骤
1．标准曲线的制作
（1）将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%和2%的稀释液。
（2）吸取淀粉稀释液2.0mL加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0mL，40℃水浴保温5min。
（3）加蒸馏水1mL，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10mL。
（4）吸取反应液1mL，加稀碘液10mL，混匀，在660nm下测得吸光度A（用2.0mL蒸馏水代替步骤
（2）中的淀粉稀释液作为对照）。
（5）以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
标准曲线：
2．淀粉酶活力测定
用2%可溶性淀粉按1
（2）操作，用稀释后的粗酶液1mL代替1（3）中的蒸馏水，测得吸光度A660，从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
淀粉稀释液/mL
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
缓冲液/mL
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
40℃水浴锅保温5min
蒸馏水/mL
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
粗酶液/mL
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
40℃保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混匀吸取反应液1mL
稀碘液/mL
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
A660
0.55
0.57
0.571
0.556
0.516
0.479
0.065
0.079
0.073
0.082
淀粉浓度/%
1.721
1.778
1.780
1.738
1.624
1.519
0.343
0.383
0.366
0.391
消耗淀粉量/（mg/ml）
2.793
2.224
2.196
2.622
3.759
4.810
16.571
16.17
16.344
16.088
酶活力
1.396
1.112
1.098
1.311
1.879
2.405
8.286
8.087
8.172
8.044
3．酶活力计算
酶活力以每毫升粗酶液在40℃，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。
实验四实验菌株的培养基条件的优化
一、实验目的
1．了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出实验菌株的最佳培养条件。
2．掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。
二、实验原理
发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中氮源比例。
但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加入碳氮源。
培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。
工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。
选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。
由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化实验。
发酵培养基中的原料多是大分子物质，微生物一般不能直接吸收，必须通过胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“迟效性”营养物质。
而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养基中添加一些速效营养物。
三、材料与器材
1．菌种
实验菌种。
2．培养基
以基本培养基为基础，分别添加葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖作为碳源。
3．器材
电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、超静工作台。
四、方法与步骤
1．查阅资料，选定培养基中碳源的含量，计算出对应的葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖的量（以碳含量相同为准则）；配置相应培养基。
2．将实验菌株接种至新鲜的基本培养基中，30℃培养过夜。
3．将上述菌悬液以10%的接种量接种至各个培养基中，30℃，180rpm培养，培养时间以之前测出酶活最高点为准。
4．检测各个培养基培养的实验菌株的菌含量及酶活量。
五、结果记录
碳源
葡萄糖
果糖
乳糖
可溶性淀粉
蔗糖
A560
0.817
0.785
0.526
0.897
0.638
A660
0.287
0.28
0.019
0.037
0.414
1、各个碳源对实验菌株生长的影响图
从芽孢杆菌生长情况来看，用淀粉作碳源最为合适。
（不同碳源对实验菌株生长量由大到小顺序为：
可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。
）
2、各个碳源对实验菌株产酶的影响图
从芽孢杆菌的生产淀粉的酶活力的情况来看，以乳糖为碳源的培养基最佳。
（不同碳源对实验菌株产酶酶活力由大到小顺序为：
乳糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖。
）
六．思考题
1.如若通过鉴别性培养基鉴定该实验菌株不产生透明圈，是否可以认定该菌就不产淀粉酶？
原因是什么？
不可以。
原因还有可能是该菌产的淀粉酶很少，透明圈不明显；或是培养时间不够，还没有开始产淀粉酶。
不一定代表该菌就不产淀粉酶。
2．如果每次从同一摇瓶中取出1mL进行测定，会对结果产生怎么样的影响？
这样的话前面测的值与后面测的值除了培养时间不同之外，培养液的多少等其他条件也不相同，无法在只有一个变量的情况下相互对照，结果会变得不准确。
3．本实验中产物形成量用淀粉酶活力来表征，是否合适？
为什么？
合适。
产生的淀粉酶用来分解淀粉正好是酶活力在此次试验的定义即以每毫升粗酶液在40℃，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数。
4．根据实验所得曲线，我们可以得到哪些结论？
一段时间内枯草芽孢杆菌量不断增加，超过一段时间后开始缓慢减少。
而酶的活力也随时间先升后降，最高处有一个酶活力最高的时间。
5.查阅相关资料，提出切实可行的提高酶活量的相关措施。
1）培养基的成分以及含量应该选择最佳的量。
2）最佳的培养时间和温度。
3）温度、pH等条件适宜。
4）适当添加有益于菌体生长的物质。
6.根据本实验设计的思路，请设计考察不同氮源的种类及含量对实验菌株生长和产酶的影响。
1）将实验菌株接种至新鲜的基本培养基中，30°C培养过夜。
2）查阅资料，选定培养基中氮源的含量，计算出对应的植物蛋白、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵的量（以碳含量相同为准则）；配置相应培养基。
3）将上述菌悬液以0.2ml的接种量接种至各个培养基中，30℃，180rpm培养，培养时间以之前测出酶活最高点为准。
4）检测各个培养基培养的实验菌株的菌含量及酶活量。
实验小结
本次实验主要是是产淀粉酶细菌的优化实验。
步骤就是筛选产淀粉酶的菌株，测出生长曲线及酶活力，最后找出最适合菌株生长及产酶的碳源。
在加可溶性淀粉15g/L的鉴别性培养基上涂布的菌液稀释倍数太低，导致10-3的平板菌落生长的太密集而无法计数，这是以后实验要注意的。
鉴别性培养基上菌落生长的大致规律是稀释倍数越小的，长得菌越多越密，也比较小；稀释倍数大的平板上的菌长得菌比较少，但是明显比稀释倍数少的平板要长得大。
在实验中，在用稀碘液滴定透明圈时，要注意不要滴到菌上，挑取菌株时选择长得比较大的单菌落挑取。
在测定生长曲线时，要适当稀释菌液，我们稀释了6倍。
配制培养基时不要忘记调PH，实验过程中注意操作规范。
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