GABRG2基因突变与癫痫相关性研究进展全文.docx

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GABRG2基因突变与癫痫相关性研究进展全文

-aminobutyricacidAreceptor,GABAaR）是一种由异五聚体构成的配体门控性氯离子通道，最常见的构型为0（旳2,主要介导脑内的GABA能抑制性通路⑴】。

GABAaR功能的正常发挥取决于各个亚基的正确合成、组装及上膜，是GABA能抑制通路起作用的重要保障I®。

其中由GABRG2基因编码的丫2亚基对受体上膜及在突触后膜的聚集至关重要［⑹。

GABRG2基因是GABAaR亚基中最常见的癫痫致病基因，该基因突变可导致多种癫痫综合征，具有明显的表型异质性【14】。

文中就GABRG2基因突变与癫痫相关性的硏究进展做一综述。

本文检索数据来源：

中国期刊全文数据库、中国生物医学文献服务系统、万方数据库、PubMed.SCI-HUB。

检索关键词:

"癫痫""发病机制""离子通道""受体，GABA-A""GABRG2基因"等。

文献发表时间：

2001年1月至2020年5月。

—、GABAAR型受体的合成及组装

GABAA型受体是一种由异五聚体构成的配体门控性氯离子通道，属于富含半胱氨酸环的离子通道超家族，在中枢神经系统中广泛表达，主要介导脑内GABA能抑制性通路的传递。

共有19个亚基（cd~6、°1~3、y1~3、6、tt、p1~3、£s6）参与构成该受体，每一个亚基都含有4个跨膜结构区域（transmembranedomainszTM1~4）,—个大的细胞外N末端，一个短的胞外环及细胞外C末端和一个长胞内环，其中每个亚基的TM2区参与形成离子流动的孔隙［15,16］。

各个亚基的正确合成、组装及上膜是GABAAR功能正常发挥的必要条件［16］°GABAA型受体基因在细胞核中转录为前体mRNA，在mRNA剪切机制的作用下去除内含子并加工成为成熟的mRNA,出核后在核糖体中翻译成多肽，随后被转运到内质网内腔中进行加工折叠。

在内质网中，这些未折叠的多肽链通常先进行N-末端糖基化修饰，接舂折叠成由二硫键固定的二级或三级结构。

折叠好的亚基在内质网分子伴侣如钙连接蛋白及免疫球蛋白结合蛋白等的协助下形成多种形式的二聚体，如同源二聚体（cea卩叩）或异源二聚体（*p、P-y），其中只有ex叩的组装形式可与其他亚基继续组装形成异五聚体［17］。

成功折叠和组装好的异五聚体转运到高尔基体中进行进一步的加工。

在高尔基体中，主要对y2亚基胞内环的半胱氨酸残基进行棕柵酰化,这种修饰可调节GABAA型受体在突触后膜的聚集性，接着在多种分子的协同作用下运输到膜［18,19,20］。

在这一系列过程中，多种细胞机制对其进行质量控制，以保证受体在细胞膜上正常表达并发挥功能。

这些质控机制主要包括mRNA水平的无义介导的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）和蛋白水平的未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse,UPR）。

NMD是真核生物中广泛存在、高度保守的mRNA质量监控系统。

在真核细胞中，无义突变、移码突变或选择性剪接会导致提前终止密码子（prematureterminationcodon,PTC）的岀现z当PTC位于外显子复合物上游50-55个核苜酸处或PTC导致mRNA出现异常的3'端非翻译区（3'untranslatedregion,3'UTR）时［21］,细胞将启动NMD,降解这些含有PTC的异常mRNA,以避免截断蛋白在细胞内的产生和聚集［22,23］。

然而，不同类型的细胞其NMD效率不同，且通常不能完全清除异常的mRNA。

未清除的异常mRNA将会翻译为截断蛋白，这些截断蛋白以及其他突变类型所产生的未折叠或错误折叠的亚基在内质网中聚集,从而激活UPR［24］。

UPR会启动或加速一系列反应清除异常亚基以缓解内质网的压力，其中，泛素化蛋白酶体及自噬溶酶体等内质网相关蛋白降解（ER-associateddegradation,ERAD）为其主要途径［25,26］。

然而，不同的亚基类型、突变性质和突变位置导致的ERAD效率不同,当堆积的异常蛋白超过ERAD的清除能力，UPR将会启动细胞凋亡程序。

二、GABRG2基因突变及其表型

GABAAR是氯离子通道的配体门控性受体，通常情况下，当其内源性激动剂GABA与之结合时，通道开放引起氯离子内流，使神经元超极化进而产生抑制效应。

大部分GABAAR由2个娅基、2个卩亚基和1个y2亚基或6亚基构成。

文献报道，a1x门〜3、y2及6亚基基因

（GABRA1、GABRB1、GABRB2.GABRB3、GABRG2及GABRD）突变均可以导致癫痫的发生，其中位于GABRG2基因的癫痫致病性突变最为常见［27,28］。

GABRG2基因位于5号染色体，编码GABAAR的y2亚基，该亚基在受体运输到膜及在突触后膜聚集的过程中具有重要作用［18］。

此外，包含y2亚基的受体对苯二氮罩类药物敏感，与之结合可増强GABA与受体的相互作用［29］。

纯合敲除GABRG2基因的小鼠在两周之内死亡，说明GABRG2基因的正常表达对个体生长发育至关重要［30］。

截至2019年4月，人类基因突变数据库（TheHumanGeneMutationDatabase）共报道了55个位于GABRG2基因的可能致病或致病性突变，其中20个突变已有离体或在体实验数据验证其致病性。

这些突变位于丫2亚基的不同位置，包括N末端、跨膜结构域、胞内环及胞外坏，其类型有错义突变、无义突变、移码突变及剪切突变（图1）。

在已报道的GABRG2突变中，以错义突变最为常见，且多数位于亚基的N-末端（如N79S、R82Q、P83S、A106T、I107T、R177G及G257R等）。

携带错义突变的患者表型各异，主要表现为热性惊厥（febrileseizures,FS）［31］、儿童失神癫痫（childhoodabsenceepilepsy,CAE）［32］xRolandic癫痫（RE）［33］、遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（geneticepilepsywithfebrileseizuresplus,GEFS+）［34］和癫痫性脑病（epilepticencephalopathiesfEE）等［35］,其中携带新发突变的患者表型较携带遗传性突变的患者表型严重。

离体细胞实验发现，这些位于N-末端以及TM1（P282S）、TM2（P302L、R323W、R323Q）、TM3（F343L）区域的错义突变均不同程度地导致Y2亚基在细胞膜上的表达量下降［33,35,36］;位于短胞外环的K328M突变主要通过缩短GABAAR通道平均开放时间进而改变了通道的动力学性质［37］。

图1已进行功能验证的GABRG2基因突变在y2亚基上的位置（作者

原创）

Figure1Figure1y2SubuintlocationofpreviouslyfunctionallyverifiedGABRG2variants（originalbytheauthors）

在无义突变中，携带Q40X和Q390X突变的患者以婴儿严重肌阵挛性癫痫（Dravet综合征）为主要表型［38,39］,携带R136X［40］和W429X［34］突变的患者主要表现为GEFS+。

Q40X与R136X突变位于亚基N-末端，Q390X及W429X突变位于胞内环，这些无义突变导致丫2亚基不在细胞膜上表达。

2002年Kananura等［41］首次在1个以CAE及FS为表型的小家系中发现了GABRG2基因的剪接供体突变（IVS6+2T—G）。

据预测，该位点突变导致GABRG2基因的前体mRNA在加工时跳过第6号内含子的剪接，并激活了1个隐蔽的剪接位点，造成7号外显子出现移码进而产生了PTC。

体外实验证明该突变所产生的异常mRNA部分通过NMD降解，未降解部分翻译为截断亚基，其运输上膜的能力受损［42］。

2013年Tian等［43］在以GEFS+为表型的家系中发现了1个位于GABRG2基因的移码突变——S443delCo在该家系中，4例患者及1名正常人携带此突变，呈不完全外显的常染色体显性遗传。

S443delC移码突变使得Y2亚基的443号氨基酸缺失，引起固有的终止密码子突变并在3'UTR端产生1个新的终止密码子，最终导致y2（S443delC）亚基的C-末端相比野生型缺失24个氨基酸，同时额外获得了50个不同于野生型的氨基酸。

离体细胞实验发现，该突变导致丫2（S443delC）亚基合成减少，且滞留于内质网中，未在细胞膜上表达。

三、GABRG2基因突变表型异质性的机制研究

GABRG2基因突变的临床表型具有明显的异质性。

该基因突变可引起相对良性的、可能随着年龄的増长而缓解的FS、RE及CAE,比较严重的GEFS+以及最严重的EE，比如Dravet综合征、婴儿痉挛（West综合征）和婴幼儿肌阵挛-失张力癫痫（Doose综合征）等（表1）o研究发现，GABRG2基因突变通过不同的分子机制导致GABAAR功能低下或丧失，属于功能丧失性（loss-o仁functi。

n,LOF）突变［44,45］。

杂合敲除小鼠的GABRG2基因（Gabrg2+/-）在一定程度上模拟了LOF突变表型，该小鼠在C57/BL/6J的遗传背景下只表现岀焦虑行为，但在癫痫易患的基因背景（DBA/2J）下可出现自发性癫痫发作，说明在不同基因背景下，GABRG2基因突变表型有所不同［45］。

GABRG2基因突变的表型异质性不仅与个体的遗传背景相关，且与突变的性质、位置以及遗传方式有关。

一般而言，错义突变所导致的表型较轻，而无义突变及新发突变导致的表型较为严重。

刼已删魏证紀ABKG2範突沁（任者翩J）

Table1ThepheoctypesofGABRG2variantsthathavebeenprevious^fuocticnalyverified（origins!

bytheauthcrs）

戾病/琏

R17TO

K320f<\V429X.R136X.SM3delC

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Rolandic^

G257R、［38%R323Q

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R82Q、WS642Z

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A106T.I107T.P2B25.R323W、F343L

全遜詐冷

N79S、P83S

体内外研究提示，GABRG2基因突变可能的致病机制包含：

（1）突变不同程度地影响y2亚基的合成和（或）在细胞膜上的表达；

（2）突变直接改变受体通道的动力学特性；（3）显性负性抑制效应；（4）突变亚基造成细胞毒性。

除K328M突变（该突变缩短了GABAAR通道的开放时间，进而改变了受体通道的动力学特性），GABRG2基因突变均不同程度地影响Y2亚基在膜上的表达，进而降低细胞表面受体密度或改变受体构型。

错义突变R82Q和P83S使得y2亚基在细胞中的稳定性降低，且导致y2亚基的折叠运输上膜能力受损，进而滞留于内质网，通过激活ERAD不同程度地将其降解，最终只有10%〜40%的y2亚基表达于细胞膜上［39］。

R177G突变主要影响y2亚基从内质网向高尔基体的转运能力。

2014年Todd等［46］发现R177G突变破坏了丫2与其他亚基之间的盐桥，且y2（R177G）亚基相较于野生型丫2亚基缺乏高尔基体中的糖基化，表明y2（R177G）亚基主要滞留于内质网中。

此外，作者通过分别构建表达野生型受体cdp2y2、杂合突变型受体a1p2y2/Y2（R177G）及纯合突变型受体cd阳y2（R177G）的HEK-293T细胞系，并用不同的标签肽对野生型及突变型的y2亚基进行标记，来检测其在细胞膜上的表达量。

发现相较于野生型受体，杂合型受体及纯合型受体中的Y2亚基（包含野生型及突变型）在细胞膜上的表达量分别降低了20%〜60%。

且与纯合突变受体相比，杂合型受体中y2（R177G）亚基在细胞膜上的表达量更低，约为纯合型受体中y2（R177G）亚基表达量的25%,说明在杂合型受体的组装中，野生型的y2相较于丫2（R177G）亚基更有优势。

无义突变、移码突变及剪切突变均导致Y2亚基在膜上的表达缺失。

其中Q40X［38］、R136X（40］和IVS6+2T—G［43］突变满足激活NMD的要求，即PTC位于外显子复合物上游的50-55个核背酸处，NMD在mRNA水平将其不同程度地降解，未降解部分与W429X［34］、S443delC［43］突变所产生的截断蛋白类似，在细胞中的稳定性降低，且滞留于内质网中通过ERAD途径将突变亚基进行不同程度地代谢。

Q390X突变导致丫2亚基的稳定性远高于野生型亚基，与其他野生型亚基错误折叠形成大分子复合体，稳定存在于内质网中［47］。

在GABAA型受体合成的过程中，若其亚基基因发生突变，细胞会采取一系列措施（如NMD、ERAD等）降解其所产生的异常蛋白，以保证受体合成的正确性。

当未折叠或错误折叠的亚基不能被细胞及时有效地清除时，突变亚基将会与野生型的亚基组装，滞留于内质网中，干扰其他野生型亚基上膜，进一步影响GABAA型受体在细胞膜上的表达，这种效应称之为显性负性抑制。

不同突变具有不同程度的显性负性抑制效应，主要与突变亚基在细胞中的稳定性有关。

其中，Q390X突变的显性负性抑制效应最为严重［47］,R82Q、W429X、R177G、IVS6+2T—G突变次之［46,48］,Q40X、R136X和S443delC突变尚未发现具有该效应。

当突变亚基及其聚合物超过细胞的清除能力，异常蛋白在神经元中进一步堆积，UPR将会启动细胞凋亡等毒性反应，导致神经系统退行性病变［24,49］。

综上所述，GABRG2基因突变所产生的病理变化可能是由于突变蛋白导致受体通道功能受损和（或）细胞稳态紊乱的综合作用。

当GABRG2基因发生突变时，由于不同个体的NMD及ERAD效率具体时空特异性，神经元对异常的mRNA及突变亚基的反应及代谢能力各异，使得GABAAR在突触后膜上的表达相应地受损，从而引起脑内GABA能抑制性通路功能不同程度地降低，此外，部分突变的亚基（如Q390X突变）可启动神经元凋亡，产生神经退行性病变，最终导致多种临床表型不同的癫痫综合征。

四、GABRG2基因突变与癫痫的治疗

GABRG2基因突变为癫痫的治疗策略提供了新的分子靶标。

常规的抗癫痫药主要通过直接或间接调节神经传递而起作用。

基于GABRG2突变的机制学硏究发现，增强野生型和（或）突变的GABAAR通道功能、降低突变GABAAR亚基及其聚合物对细胞信号传导的干扰可能为癫痫的潜在治疗方法。

2017年Huang等［49］通过将Gabrg2Q390X/+杂合敲入鼠与过表达人源y2亚基的转基因小鼠杂交，以期在Gabrg2Q390X/+鼠中引入功能正常的GABRG2等位基因，并通过蛋白质印迹和免疫组织化学染色比较了杂交前后的Gabrg2Q390X/+鼠中GABAAR亚基的表达情况。

发现杂交后Gabrg2Q390X/+小鼠的野生型Y2、«1和阳/3亚基表达量明显增加，且大脑皮质的突触后抑制性电位幅度显著增大。

因此，利用靶向基因替代或小分子干扰RNA来促进野生型GABAA受体通道功能，并消除非功能性突变蛋白的细胞毒性作用可能为癫痫个体化精准治疗新的依据。

五、结语

GABRG2基因作为最常见的癫痫致病基因之一，其突变产生的表型异质性为研究多种癫痫综合征的发病机制提供了很好的切入点，也为癫痫的精准治疗提供了新的思路。

目前虽已有诸多关于GABRG2基因突变与癫痫的基础研究，但主要是以细胞系为载体，缺乏神经元及大脑网络的复杂性。

因此，利用规律间隔成簇短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）等基因编辑技术构建动物模型是未来研究GABRG2基因突变与癫痫发病机制及治疗的主要方向之一。