cdna文库构建流程.docx
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cdna文库构建流程
cDNA文库组标准流程
一.TotalRNA的提取2
二.mRNA的分离5
三．cDNA双链合成8
四．载体制备1.1
五.cDNA双链和载体的连接13
六．电转化流程14
七．快速鉴定、菌落PCR16
八.pBlueScriptcDNA库扩增18
.TotalRNA的提取
1.试剂配制
准备工作：
1、研钵、5ml/10ml/25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内，180C,烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1%。
DEPC水浸泡过夜后，121C20mins高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：
▲DEPC水：
在1000ml去离子水中加入100ulDEPC,静置过夜后高压灭菌。
▲
0.78M柠檬酸钠10%肌氨酸钠异硫氰酸胍加DEPC水定容至
0.78M柠檬酸纳：
PH=4~5
三水合柠檬酸纳22.94g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：
肌氨酸钠10g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：
8.25ml
12.375ml
118.05g
250ml，室温放置备用
▲2M醋酸钠
临用前加B-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）
PH=4.5
NaAc•3H2O13.6g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲3M醋酸钠PH=5
NaAc•3H2O20.4g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲4MLiCL:
LiCL24.164g
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用
▲0.5MEDTAPH=8.0EDTA18.61g
用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用
▲10XMOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）:
MOPS41.86g
NaAC•3出04.10g
0.5MEDTA（PH8.0）20ml用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。
▲1xMOPS:
10xMOPS30ml
加DEPC水270ml,用时现配。
▲4xRNALoadingbuffer:
10xMOPS400ul
甘油（高压过）200UL
溴酚兰10ul
甲醛（37%）72ul
去离子甲酰氨310ul
EDTA（0.5MPH8.0）8ul
ErBr（10mg/mlinDEPCH2O）70ul
在4C可保持3个月
▲10xPBS
pH=7.4
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO414.4g
KH2PO42.4g
定容至1000ml
▲变性电泳胶：
称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml1xMOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50E左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液：
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1xMOPS定容至250ml
2•动物组织totalRNA的提取
1.根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。
2.将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。
3.根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。
4.根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
5.冰浴10分钟。
6.4C，12000g离心20分钟。
7.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8.加入等体积的异丙醇，-20C沉淀30分钟以上。
9.4C,12000g离心20分钟。
10.根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11.加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
12.4C,12000g离心20分钟。
13.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，-20C沉淀至少30分钟。
14.4C,12000g离心20分钟。
15.弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。
4C,12000g离心10分钟。
16.弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。
用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17.取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置—80C冰箱中保存。
表1
Mg#oftissue
500
800
1000
变性裂解液（ml）
5
8
10
2MNaOACpH4（ml）
0.5
0.8
1
水饱和酚（mL）
5
8
10
氯仿（mL）
1
1.6
2
异丙醇（mL）
4
6
8
变性裂解液（mL）
0.5
0.8
1
异丙醇（mL）
0.5
0.8
1
75%乙醇（mL）
1
1
1
DEPC-treatedH20（mL）
0.5
0.8
1
3.植物组织totalRNA的提取
I.先将研钵于-80C冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2•将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。
（1g样品加入3ml变性裂解液）。
3.加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4—5）颠倒混匀。
4.加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。
5.冰浴10min。
4°C，12000g离心10min
6.小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，一70C沉淀至少1小时。
7.4C，12000g离心20min。
8.去上清，取沉淀。
加1ml4M的LiCl溶解沉淀（1mlLiCI/g组织），并转入1.5ml离心管中。
9.4C，13000rpm离心15min。
10.用0.4mlDEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。
II.4C，13000rpm离心10min。
12.取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，—70C沉淀30min以上。
13.4°C,13000rpm离心15min。
14.弃上清，用1ml75%的乙醇洗涤沉淀，4C,13000rpm离心10min。
15.弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。
16.用40-60ulDEPC水溶解（300-500ug/g）RNA沉淀。
17.取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置—80C冰箱中保存。
4.TRIzolReagent提取totalRNA（GIBCO）
1.查表2根据样品量选择适当的TRIzolReagent体积装入50mlRNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzolReagent体积的10%
2.将组织样品放入TRIzolReagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。
3.室温温育10分钟。
4.据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。
5.4oC,12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%
6.转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中。
根据表2加入适量异丙醇,-20oC沉淀1小时以上。
7.4oC,12000g离心10分钟。
8.去上清，据表2加入适量体积的75%勺乙醇混匀。
9.4oC,7500g离心5分钟。
10.去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。
加入适量体积的DEPC-WATE溶解沉淀。
11.取少量RNAffl于测定其OD值和电泳，其余置-80oC冰箱中保存。
表2
组织量
TRIzolReagent
氯仿
异丙醇
75%^醇
50~100mg
1ml
0.2ml
1ml
1ml
l.mRNA的分离
1.OligotexmRNAKits（QIAGEN）法
准备工作：
1.将OligotexSuspension置于37C水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.，然后置于室温。
2.将OBBBuffer置于37C水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。
3.将OEBBuffer置于70C水浴中，待用。
试验步骤：
表3:
加入试剂量据此表
TotalRNA
RNase-freeWaterto:
BufferOBB
（ul）
Oligotex
Suspension（ul）
Prepsize
<=0.25mg
250ul
250ul
15
Mini
0.25-0.5mg
500ul
500ul
30
Midi
0.5-0.75mg
500ul
500ul
45
Midi
0.75-1.00mg
500ul
500ul
55
Midi
1.TotalRNA量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-freewater补足到500ul
2.根据表3加入适当体积的OBBBuffer和OligotexSuspension,轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3.置于70C水浴中3min
4.取出置于室温（20C—30C）10min
5.13000rpm室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管
中，保留上清直到polyA被结合上。
6.用移液器取400ulOW2Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到Spin
Column中，RT，13000rpm,离心1min
7.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ulOW2，RT，13000rpm，离心1min
8.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml管中，取出25ulOERBuffer（70C）到Column中，用移液器吹打3—4次树脂，室温13000rpm,离心1min。
9.取出25ulOERBuffer（70C）到Column中，用移液器吹打3—4次树脂，室温13000rpm，离心1min。
10.测OD,并电泳定量。
2•磁珠法分离mRNA
1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2.65oC加热10分钟。
3.加入3ul生物素标记的Oligo（dT）和13ul20xSSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。
4.同时配0.5xSSC1.2ml和0.1xSSC1.4ml.
5.将磁珠（sa-pmps轻晃散开，放入磁性分离架上，使sa-pmps集中于管的一
侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。
用0.3ml0.5xssc漂洗SA-PMPs,
用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。
6.将漂洗后的SA-PMP重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPi应在30分钟内使用。
7.将（3）中的oligo（dT）/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPst中，轻轻摇匀，室温下放10分钟。
8.用磁性分离架捕获SA-PMPs小心去上清，但不要弃去。
9.用0.1xSSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPj#浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.
10.将SA-PMP重新悬浮在0.1mlRNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPS散开,洗脱mRNA
11.用磁性分离架捕获SA-PMPs将洗脱的mRN吸入另一个新的Eppendorf管中。
12.将SA-PMPj再悬浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。
13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。
14.加0.1体积的3mol/lNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20oC沉淀过夜。
15.4oC,13000g离心60分钟。
去上清，加入500ul70%乙醇混匀。
16.4oC,7500g离心10分钟。
17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。
18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项：
1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行
2•如果totalRNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA相反则可以用磁珠法。
3.mRNA勺电泳图是smear。
cDNA双链合成
1.SupersciptII—RT合成第一链:
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中，加入
xulmRNA（大约500ng）1ulXhoIPrimer（1.4ug/ul）
（5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3'）
11-xulRNase-freewater（大于500ngmRNA分n管（500ng/tube合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2.混匀后,70C反应10分钟；
3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul5Xfirststrandbuffer
2ul0.1MDTT
1ul10mMdNTP（自己配制）
5.混匀，稍微离心反应物之后，42C放置2分钟；
6.反应完成，趁热加入1ulSupersciptII—RT,混匀；
7.42T反应50分钟，然后70C,15分钟灭活反转录酶.
2.cDNA第二链的合成:
1.第一链反应完成后，取2ul一链产物—20C冰箱中保存，待电泳检测。
其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂（promega）:
20ul
10XDNAPolymeraseIbuffer
6ul
10mMdNTP（自己配制）
xul
ddH2O
1ul
RNaseH（2U/ul）
10ul
DNAPolymeraseI（10U/ul）
总体系为200ul；
2.混匀后，16C反应2.5小时；
3.70E灭活10分钟；
4.反应完成后，得到200ulcDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上；
5.取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。
同时上1kbladder,确定双链的大小范围。
注：
一链，二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。
3.双链cDNA末端补平:
1.在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂（promega）:
6ul10mMdNTP
2ulT4DNAPolymerase（8.7U/ul）
2ulBSA（10mg/ml）
2.稍微离心混匀反应物,37C反应至少30分钟然后75C灭活10分钟；
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟；
4.离心后，吸取上清于另一1.5mleppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟；
5.吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3MNaAc（PH5.2）和2.5V预冷的无水乙醇，混匀,-20E放置过夜以沉淀双链cDNA;
6.第二日，将昨日沉淀物在4C,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕，弃上清，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟；
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：
第3,第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。
PCR屯化试剂盒操作流程：
1•溶液PE使用前应加入适量体积95%—100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB,混匀。
3.加入spincolumn中，13000rpm离心1min。
4.加入0.75mlbufferPE,13000rpm离心1min。
5.13000rpm,再离心1min。
6.将spincolumn放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。
7.13000rpm离心2min。
8.加入30ulbufferEB，静置10min。
9.13000rpm离心2min。
10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇，混匀，—20C沉淀过夜。
4EcoRIadaptor加接:
1.往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor（400ng/ul）4C至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀；
2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul10xLigaseBuffer
1ul10mMrATP
1ulT4DNALigase（4U/ul）
3.混匀后,4C连接3days或者8C过夜连接；
5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:
1.连接反应完成后，将反应体系70C放置15分钟灭活T4DNALigase;
2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul10xLigaseBuffer
1ul10mMrATP
6ulddH2O
1ulT4PNK（10U/ul）
3.37C反应30分钟，然后70C灭活15分钟；
4.稍微离心使反应物集中至管底；
5.室温放置5分钟；然后加入下列试剂:
4ulXho10xBuffer
2ulBSA
5ulddH2O
8ulXhoI（10U/ul）
6.37C反应1.5小时然后65C灭活酶10分钟；
7.反应完成，双链cDNA合成完毕。
置于4°C准备回收。
6.胶回收cDNA（QIAEXIIGELExtractionKit回收试剂盒）1．配制小胶数板（每个样品一板）：
1%琼脂糖凝胶，2ulEB/300ml胶
2.取4C保存样品上样，40ul/孑L。
3．电泳50V；1hr
4.紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5.称取胶重，加入三倍体积bufferQXI（例如，100mg胶中加入300ulbufferQXI）
6.50C水浴数分钟，至胶完全融化。
用手指弹QIAEXII使重悬，每管中加入5ulQIAEXII
7.50C水浴10min,每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEXII保持悬浮
8.4C，13000rpm,30sec。
（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9.加入500ulbufferQXI，轻弹管底使QIAEXII重悬
10.离心并去上清（同操作8）
11.加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，去上清
12.再加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13.超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ulelutionbuffer，重悬QIAEXII，静置5min，13000rpm,30sec。
吸上清，冰上放置。
14.取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kbladder）及DNA含量标准（10ng,20ng）作对照。
15.将收回的cDNA置于-20C内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1.胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1％的HCl浸泡过夜。
2.胶回收时电压要稳定。
四．载体制备
1．pBlueScriptII的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP勺LB平板上，37C培养过夜。
2.第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10mlAMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37C,250rpm,培养过夜。
3•第三天取200d小摇后的菌液接种于250ml含AMP勺LB液体培养基中，37C,250rpm培养6hr左右，使OD值达到0.6-0.8。
4.将菌液移入250ml离心管中，4°C，3000rpm,离心15min。
取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。
（注意离心前需配平）
5.加入10ml溶液1（50mMGlucose，25mMTris-HCI，10mMEDTApH8.0），加入RNase至终浓度100dg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。
6.按NaOH（0.4N）:
SDS（2%--1:
1的比例新鲜配制溶液U,加入20ml溶液U，静置3-5min。
注：
静置时间勿超过5min,提前将溶液川置于冰盒中。
7.加入15ml冰浴的溶液川，冰浴15-30min。
8.4C,5000rpm,离心15min。
9.取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。
10.每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。
11.20C,12000g,离心20min回收质粒沉淀。
12.弃上清，用70％的乙醇洗2次。
13.弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。
14.用3mlTE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5mlEppendof离心管中。
15.电泳检查DNA质量并定量。
（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。
）
2.pBlueScriptII的双酶切消化
1.以如下体系进行EcoRI酶切：
pBSK（+）Xdl（6dg）
ddH2O174-Xdl
10XBufferE20d
混匀，加入限制性内切酶：
EcoRI（10U/dl）6dl
总体积为200dl。
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。
3.37C，水浴1hr。
4.加入200ul1:
1的酚/氯仿，混匀。
4C,13000
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