cDNA文库建库流程Word文档下载推荐.docx
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▲4MLiCL:
LiCL24.164g
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用
▲0.5MEDTAPH=8.0
EDTA18.61g
用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用
▲10XMOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）:
MOPS41.86g
NaAC·
3H2O4.10g
0.5MEDTA（PH8.0）20ml
用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
▲1xMOPS:
10xMOPS30ml
加DEPC水270ml，用时现配。
▲4xRNALoadingbuffer:
10xMOPS400ul
甘油（高压过）200UL
溴酚兰10ul
甲醛（37%）72ul
去离子甲酰氨310ul
EDTA（0.5MPH8.0）8ul
ErBr（10mg/mlinDEPCH2O）70ul
在4℃可保持3个月
▲10xPBS
pH=7.4
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO414.4g
KH2PO42.4g
定容至1000ml
▲变性电泳胶：
称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml1xMOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液：
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1xMOPS定容至250ml
2.动物组织totalRNA的提取
1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。
2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。
3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。
4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
5．冰浴10分钟。
6．4C，12000g离心20分钟。
7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。
蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8．加入等体积的异丙醇，-20C沉淀30分钟以上。
9．4C，12000g离心20分钟。
10．根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11．加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
12．4C，12000g离心20分钟。
13．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20C沉淀至少30分钟。
14．4C，12000g离心20分钟。
15．弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。
4C，12000g离心10分钟。
16．弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。
用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17．取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80C冰箱中保存。
表1
Mg#oftissue
500
800
1000
变性裂解液（ml）
5
8
10
2MNaOACpH4（ml）
0.5
0.8
1
水饱和酚（mL）
氯仿（mL）
1.6
2
异丙醇（mL）
4
6
变性裂解液（mL）
75%乙醇（mL）
DEPC-treatedH20（mL）
3.植物组织totalRNA的提取
1.先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。
（1g样品加入3ml变性裂解液）。
3.加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。
4.加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。
5.冰浴10min。
4℃，12000g离心10min
6.小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。
7.4℃，12000g离心20min。
8.去上清，取沉淀。
加1ml4M的LiCl溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。
9.4℃，13000rpm离心15min。
10.用0.4mlDEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。
11.4℃，13000rpm离心10min。
12.取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。
13.4℃，13000rpm离心15min。
14.弃上清，用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。
15.弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。
16.用40－60ulDEPC水溶解（300-500ug/g）RNA沉淀。
17.取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。
4.TRIzolReagent提取totalRNA（GIBCO）
1．查表2根据样品量选择适当的TRIzolReagent体积装入50mlRNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzolReagent体积的10%。
2．将组织样品放入TRIzolReagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。
3．室温温育10分钟。
4．据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。
5．4º
C，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。
6．转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中。
根据表2加入适量异丙醇，-20º
C沉淀1小时以上。
7．4º
C,12000g离心10分钟。
8．去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9．4º
C，7500g离心5分钟。
10．去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。
加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11．取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80º
C冰箱中保存。
表2
组织量
TRIzolReagent
氯仿
异丙醇
75%乙醇
50~100mg
1ml
0.2ml
二.mRNA的分离
1.OligotexmRNAKits（QIAGEN）法
准备工作：
1.将OligotexSuspension置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。
2.将OBBBuffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。
3.将OEBBuffer置于70℃水浴中，待用。
试验步骤：
表3：
加入试剂量据此表
TotalRNA
RNase-freeWaterto:
BufferOBB
（ul）
Oligotex
Suspension（ul）
Prepsize
<
=0.25mg
250ul
15
Mini
0.25-0.5mg
500ul
30
Midi
0.5-0.75mg
45
0.75-1.00mg
55
1.TotalRNA量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-freewater补足到500ul
2.根据表3加入适当体积的OBBBuffer和OligotexSuspension，轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3.置于70℃水浴中3min
4.取出置于室温（20℃－30℃）10min
5.13000rpm室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。
6.用移液器取400ulOW2Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到SpinColumn中，RT，13000rpm，离心1min
7.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ulOW2，RT，13000rpm，离心1min
8.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml管中，取出25ulOERBuffer（70℃）到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。
9.取出25ulOERBuffer（70℃）到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。
10.测OD,并电泳定量。
2.磁珠法分离mRNA
1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2.65º
C加热10分钟。
3.加入3ul生物素标记的Oligo（dT）和13ul20×
SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。
4.同时配0.5×
SSC1.2ml和0.1×
SSC1.4ml.
5.将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。
用0.3ml0.5×
ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。
6.将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。
7.将（3）中的oligo（dT）/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10分钟。
8.用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。
9.用0.1×
SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.
10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1mlRNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。
11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。
12.将SA-PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。
13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。
14.加0.1体积的3mol/lNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20º
C沉淀过夜。
15.4º
C，13000g离心60分钟。
去上清，加入500ul70%乙醇混匀。
16.4º
C，7500g离心10分钟。
17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。
18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项：
1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行
2．如果totalRNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。
3．mRNA的电泳图是smear。
三．cDNA双链合成
1.SupersciptII—RT合成第一链:
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入
xulmRNA（大约500ng）
1ulXhoIPrimer（1.4ug/ul）
（5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’）
11-xulRNase-freewater
（大于500ngmRNA分n管（500ng/tube）合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2.混匀后,70℃反应10分钟;
3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul5×
firststrandbuffer
2ul0.1MDTT
1ul10mMdNTP（自己配制）
5.混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6.反应完成,趁热加入1ulSupersciptII—RT,混匀;
7.42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2.cDNA第二链的合成:
1.第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。
其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂（promega）:
20ul10×
DNAPolymeraseIbuffer
6ul10mMdNTP（自己配制）
xulddH2O
1ulRNaseH（2U/ul）
10ulDNAPolymeraseI（10U/ul）
总体系为200ul;
2.混匀后,16℃反应2.5小时;
3.70℃灭活10分钟;
4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。
同时上1kbladder，确定双链的大小范围。
注：
一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3.双链cDNA末端补平:
1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂（promega）:
6ul10mMdNTP
2ulT4DNAPolymerase（8.7U/ul）
2ulBSA（10mg/ml）
2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAc（PH5.2）和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
第3，第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB，混匀。
3．加入spincolumn中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75mlbufferPE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spincolumn放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ulbufferEB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4EcoRIadaptor加接:
1.往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor（400ng/ul）,4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul10×
LigaseBuffer
1ul10mMrATP
1ulT4DNALigase（4U/ul）
3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:
1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNALigase;
2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul10×
6ulddH2O
1ulT4PNK（10U/ul）
3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4.稍微离心使反应物集中至管底;
5.室温放置5分钟;
然后加入下列试剂:
4ulXho10×
Buffer
2ulBSA
5ulddH2O
8ulXhoI（10U/ul）
6.37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7.反应完成,双链cDNA合成完毕。
置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA（QIAEXIIGELExtractionKit回收试剂盒）
1．配制小胶数板（每个样品一板）：
1%琼脂糖凝胶，2ulEB/300ml胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；
1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积bufferQXI（例如，100mg胶中加入300ulbufferQXI）
6．50℃水浴数分钟，至胶完全融化。
用手指弹QIAEXII使重悬，每管中加入5ulQIAEXII
7．50℃水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEXII保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。
（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ulbufferQXI，轻弹管底使QIAEXII重悬
10．离心并去上清（同操作8）
11．加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，去上清
12．再加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13．超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ulelutionbuffer，重悬QIAEXII，静置5min，13000rpm，30sec。
吸上清，冰上放置。
14．取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kbladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15．将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1％的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。
四．载体制备
1．pBlueScriptII的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。
2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10mlAMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。
3．第三天取200µ
l小摇后的菌液接种于250ml含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6hr左右，使OD值达到0.6-0.8。
4．将菌液移入250ml离心管中，4℃，3000rpm，离心15min。
取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。
（注意离心前需配平）
5．加入10ml溶液Ⅰ（50mMGlucose，25mMTris-HCl，10mMEDTA，pH8．0），加入RNase至终浓度100µ
g/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。
6．按NaOH（0.4N）：
SDS（2%）--1：
1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。
静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。
7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。
8．4℃，5000rpm，离心15min。
9．取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。
10．每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。
11.20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。
12．弃上清，用70％的乙醇洗2次。
13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。
14．用3mlTE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5mlEppendorf离心管中。
15．电泳检查DNA质量并定量。
（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。
）
2．pBlueScriptII的双酶切消化
1．以如下体系进行EcoRI酶切：
pBSK（+）Xµ
l（6µ
g）
ddH2O174-Xµ
l
10×
BufferE20µ
l
混匀，加入限制性内切酶：
EcoRI（10U/µ
l）6µ
总体积为200µ
l。
2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。
3．37℃，水浴1hr。
4．加入200ul1:
1的酚/氯仿，混匀。
4℃，13000rpm，离心15min。
5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。
6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。
7.4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
8．加入200ul70％的乙醇洗沉淀。
9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ulddH2O充分溶解沉淀。
11．加入以下试剂进行XhoI酶切：
ddH2O74µ
Buff
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