昆 明 医 学 院教 案.docx

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昆明医学院教案

昆明医科大学教案

课程名称：

法医物证学授课对象：

法医专业五年级本科生

一、讲授题目第十二章血痕检验

二、讲授时数3学时

三、讲授人：

聂胜洁职称：

副教授职务：

四、本课目的、要求

1.掌握血痕检验的目的和检验程序；

2.掌握血痕预试验、确证试验、种属鉴定的基本原理、方法、结果评判和注意事项；

3.掌握血痕ABO血型测定的原理、方法和结果评价;

4.熟悉血痕的红细胞酶型、血清型、DNA多态性检测的价值、方法及结果评价；

5.了解血痕肉眼检查的内容及意义；

6.了解血痕的性别鉴定、出血部位判断及出血量估计的方法和意义。

五、本章节重点、难点

重点：

1.血痕检验的目的和程序

2.血痕预试验、确证试验、种属鉴定的基本原理、方法、结果评判

3.血痕ABO血型测定的原理、方法

难点：

1.血痕预试验、确证试验、种属鉴定的基本原理

2.血痕ABO血型测定的原理

六、教学方法（请打勾）

传统式、提问式、学导式、病案分析式、直观教学式（幻灯、手术、录像）、自学式、其它：

七、使用教具:

多媒体

八、思考题：

1.血痕检验的顺序如被打乱，可能会导致哪些错误的判断？

2.血痕检验的哪些程序可以省略？

3.如何根据血痕检验预试验、确证试验、种属试验的不同现象进行结果解释？

4.血痕的个人识别可以从那些方面进行？

5.血痕吸收试验与解离有何异同？

6.血痕血型测定时有何注意事项？

九、要求参考书目及章节：

1.《实用法医学》，郭景元主编

2.《法医物证学》，吴梅筠主编（第一版）

3.《人类DNA遗传标记》，李生斌著

4.《法医DNA分析》，郑秀芬著

十、讲课内容及时数安排

时间：

5min

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第一节概述（现场照片，上有可疑血痕斑迹，就此设问）

概念：

血痕（bloodstain）是血液在人体外干燥后所形成的斑迹。

一、血痕的特点

血痕是最常见的物证检材。

血痕的存在，多数情况下表示有人受伤。

在凶杀、斗殴、抢劫、盗窃、碎尸、灾害事故等现场以及相关物品如致伤物、受害人与嫌疑人的衣服上大多数都会遗留下血痕。

血痕检验的结果将为案件的侦破提供线索，为案件的审判提供证据。

血液一旦离开人体，就面临外界物理、化学以及生物学因素的作用，故血痕的检验方法比临床检验复杂，比新鲜血液检验更加困难。

血痕越陈旧，检验越困难。

时间：

10min

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二、血痕检验的目的与要求★

Thepurposeandrequirementsofbloodtests.

（一）血痕检验的目的血痕检验需要解决以下问题：

1.提取和送检的可疑斑痕是否血痕？

（Bloodstainornot?

）

2.血痕是人血还是动物血？

（Humanbloodornot?

）

3.确定是人血后，检测血型以及其它遗传标记，进行个人识别。

（PersonalIdentification）

4.其它检验，如血痕的性别、出血量、出血时间及出血部位推断等。

（二）血痕检验的程序

现场上的血痕可因雨淋、日晒而变淡，凶器或衣服上的血痕又可被洗涤而难以辨认，深色衣物上的血痕易被疏忽遗漏，另一方面，许多有色物质，如油漆、颜料、酱料、泥土又可在衣物上形成暗褐色斑痕，易与血痕混淆。

此外，动物血痕和人血痕在外观上并无差别。

因此，必须进行一系列的检验，方能判断可疑的斑痕是否是血痕以及其种属来源，最后通过各种遗传标记（血型、血清型、酶型、DNA多态性）把血痕与某一个体联系在一起。

血痕检验的一般顺序为：

1.肉眼观察（VisualInspection）；2.预试验（TrialTest）；3.确证试验（ConfirmatoryTest）；4.种属鉴定（SpeciesIdentification）；5.遗传标记测定（Determinationofgeneticmarkers）；6.其它检验等（图1）。

通常检验血痕都照这一顺序逐项进行，否则不但可能浪费时间和精力，还可能得出错误的结论。

时间：

10min

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第二节肉眼观察（VisualInspection）

常常在现场进行，主要观察血痕的分布、位置、形态、大小、数量、颜色等，借以推断案件的性质，案发时间，作案过程，被害人与加害人的相对位置，出血部位，凶手的行踪等。

（结合案例图片）

时间：

15min

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第三节血痕预试验（preliminarytest）

是一种筛选试验，目的是要从大量的可疑血痕中筛除不是血痕的检材（Thepurposeofthepreliminarytestisruleoutthematerialthatisnotblood.）。

很多斑痕外观上与血痕相似，通过预实验，可排除非血痕检材。

几乎所有的血痕预试验，均具有灵敏度高、操作简便、快速的特点。

预试验多数是测定血痕中血红蛋白或其衍生物的过氧化物酶活性达到筛查血痕的目的，因为过氧化物酶在自然界广泛存在，故预试验阳性仅表示可能是血，而不能肯定是血。

血痕预试验的意义在于阴性结果，阴性结果可以否定血痕，或血痕已经彻底破坏，所有的后继检测已经失去检测条件。

（一）联苯胺试验（benzidinetest）★

1.原理：

利用血痕中的血红蛋白或正铁血红素具有的过氧化物酶活性，使过氧化氢释放出新生态氧，将无色联苯胺氧化为联苯胺蓝。

（Theory:

Thehemoglobinortheprotohemehaveperoxidaseactivity,whichcouldturnbenzidinecolourlesstoBenzidineblue.）

2.方法：

剪取或刮取微量检材置于白瓷反应板上，或用滤纸轻擦斑痕。

依次滴加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液各1滴。

1-2min后无蓝色反应，再加3%过氧化氢1滴，立即出现蓝色为阳性反应。

若不出现蓝色，为阴性反应。

（滴加顺序很重要！

为什么？

）

3、评价：

特点是灵敏度高，血液经过稀释50万倍，试验仍可能呈阳性结果。

（Highsensitivity）

联苯胺试验有两类干扰物质，一是氧化剂，例如高锰酸钾、重铬酸钾、铁锈和镍盐等，能直接将联苯胺氧化为联苯胺蓝，呈现蓝色反应。

但氧化剂造成的蓝色反应出现在未加过氧化氢之前，所以要求实验时必须按上述次序滴加试剂。

另一类干扰物质是生物源性物质如某些植物、蔬菜、水果等，本身含有过氧化酶使试验出现阳性反应。

人体液如脓液、鼻涕或有些组织浸液，细菌如大肠杆菌等也含有过氧化物酶或具有过氧化酶活性的物质，亦能使联苯胺试验呈阳性。

因此阳性结果只能说明检材可能是血痕，不能肯定为血痕。

（Benzidinetesthastwointerferingsubstance,oneisoxidant,theotherisBiologicalmaterialsource.）

所以，联苯胺试验的意义在于阴性结果，阴性可以否定血痕，除非血痕中的血红蛋白或其衍生物已经彻底被破坏。

如果真是血痕，联苯胺试验阴性，说明血痕已经彻底破坏，后续的所有检测已经失去检测条件。

注意：

联苯胺能够破坏血痕（Benzidineisabletodestroytheblood），不能再进行后面的检测，因此试验时不要将试剂直接滴在衣服或其他检材的斑痕上。

联苯胺是致癌物（Benzidineisacarcinogen），检测时应加强自我防护。

（结合案例）

（二）其他预试验

1．酚酞试验（phenolphthaleintest）的原理与联苯胺试验相同，新生态氧使还原酚酞氧化为酚酞，在碱性溶液中酚酞呈桃红色或红色。

操作方法同上。

本法灵敏度不及联苯胺试验，同样缺乏特异性。

但酚酞试剂无毒、安全，惟试剂配制过程较繁琐。

（三）无色孔雀绿试验原理是新生态氧将无色孔雀绿氧化成孔雀绿。

其灵敏度与酚酞试验相似。

操作方法相同。

时间：

15min

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时间：

15min

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第四节血痕确证试验（conclusivetest）

目的是要确证检材是否为血（Tofigureoutwhetheritisblood.），主要依据是检材中是否含有血红蛋白或其衍生物。

血痕确证试验灵敏度较低，检材有真菌生长、细菌污染或日晒、雨淋确证试验往往呈阴性反应。

因此阳性结果可确证检材为血痕，阴性结果提示检材不是血痕，或者检材量太少、已经被破坏。

因此确证试验阴性结果时，可继续作种属试验，因为常规的抗人血红蛋白血清沉淀反应的灵敏度比确证试验高。

防止因确证实验的灵敏度低而漏检了血痕。

（一）血色原结晶试验（结合显微图片）★

1.原理：

血色原结晶试验又称高山结晶试验（Takayamacrystaltest）。

血红蛋白在碱性溶液中分解为正铁血红素和变性珠蛋白。

在还原剂作用下，正铁血红素还原为血红素，同变性珠蛋白和其他含氮化合物（如吡啶、氨基酸等）结合形成血色原结晶。

血色原结晶试验的试剂又称高山试剂，由10%氢氧化钠3ml，30%葡萄糖10ml，吡啶3ml混合组成。

2.方法：

剪取或刮取少量检材，置载玻片上，用针分离成细纤维，盖上盖玻片，加1～2滴高山试剂，室温下静置10min后镜检。

出现樱桃红色星状、菊花状或针状结晶，即为阳性。

不出现结晶，为阴性反应。

3.评价：

血色原结晶试验最大的特点是特异性好（Goodspecificity），目前未发现任何其他物质，经过同样处理，能形成该樱桃红色结晶。

凡试验阳性可以肯定是血痕，所以血色原结晶试验的意义在阳性结果（Ifthereisthepositiveresult,itisconfirmthatthematerialisblood.）。

试验的缺陷是灵敏度低（Lowsensitivity），血液经过稀释200倍就难以得到典型的血色原结晶，阴性结果没有意义。

经过水洗，雨淋或变性、腐败、陈旧的血痕阳性率低。

4.注意事项：

高山试剂久置易失效（Reagentplaceiseasytofailafteralongtimelaid.），每次试验时应强调作已知血痕的阳性对照。

结晶形成的速度和结晶的形态大小与血液浓度有关。

（二）氯化血红素结晶试验（简述，结合显微图片）

1、原理：

氯化血红素结晶试验（Teichmanncrystaltest）。

血红蛋白受酸性作用，分解产生正铁血红素，其与氯离子反应成氯化血红素结晶。

游离氯离子由醋酸和氯化钠作用而产生。

2、方法：

取检材少许置玻片上，分离成纤维状。

加氯化钠少许，用玻棒压碎并与检材混合，盖上盖玻片，滴加冰醋酸1～2滴，在酒精灯上微加热，至出现一二个小气泡时即移开，待冷却后镜检。

有褐色菱形或针状结晶为阳性反应。

阳性可确证为血痕。

氯化血红素结晶试验的意义及注意事项与血色原结晶试验相同，试验的特异性好，但灵敏度低。

（三）其它确证试验吸收光谱检查

第五节种属鉴定（speciseidentification）

当可疑斑痕确定为血痕后，应确定其种属来源，明确血痕是人血还是动物血，必要时还需确定是哪种动物血。

血痕的种属试验是血痕鉴定的一个关键，因为动物血中含有某些与人血液遗传标记类似的物质，如A及B抗原，若不进行种属鉴定，直接测定血痕的ABO血型，可误将动物血判断为人血，造成错案。

即使采用DNA分析作个人识别，仍必须确定血痕是人血后才能做DNA分型检测。

（Thepurposeisensurethebloodishumanbloodtoproceedpersonalidentification.）

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沉淀反应（precipitationreaction）（简述）

沉淀反应是一种经典的免疫反应。

可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，当抗原抗体比例适合时可形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀。

血痕浸出液中的可溶性蛋白抗原，称为沉淀原，抗人血清或抗人血红蛋白抗体称为沉淀素。

抗原抗体比例适当是沉淀反应的关键。

（图示环状沉淀反应，琼脂扩散实验）（Usethespecificcombinationofantigenandantibody.）

血痕的种属鉴定常采用人的血红蛋白和人的血清蛋白免疫动物而获得相应的抗血清，即抗人血红蛋白血清和抗人血清蛋白血清。

1.种属特异性（SpeciesSpecificity）指抗体只对某一物种的组织、细胞、血清、体液、或分泌液发生特异反应的特性，而对其它种属动物的蛋白均不发生反应。

抗人血清蛋白抗体、抗人血红蛋白抗体都具有种属特异性。

2.器官特异性（Organ-Specific）指抗体只对某一器官成分发生特异反应，与其他器官蛋白均不发生反应的特性。

例如抗人血红蛋白血清既具有种属特异性，又具有器官特异性。

与动物蛋白不发生反应，与人体除血液以外的其他任何组织也不发生反应。

抗人血红蛋白胶体金试验（详，结合图示）★Colloidalgoldresistancetohemoglobintest

胶体金法是一种免疫层析技术，用该技术进行种属试验，具有灵敏度高、操作简便的特点。

1、原理：

胶体金由金化合物制备而成，带负电荷，可作为抗体染料结合物。

胶体金将抗体免疫球蛋白吸附在表面，形成一种标记了该种免疫球蛋白的“探针”，用此“探针”可以结合相对应的抗原。

此种由抗体标记后的胶体金称为免疫胶体金。

胶体金颗粒自身呈红色，当免疫胶体金颗粒结合对应的抗原后，再与抗原相应的抗体结合，免疫胶体金颗粒便被滞留而富集，出现肉眼可见的红色，据此判断阳性或阴性的结果。

2、结构：

免疫层析胶体金试剂条是将所有反应物均固定在硝酸纤维素膜上，反应利用膜的毛细作用原理。

试剂条分为加样区、反应区和吸附区三部分。

加样区贴有一层有免疫胶体金颗粒的玻璃纤维膜。

反应区有两条反应线：

一条为检测线，包被有检测抗原的抗体，如抗人Hb抗体；一条为质控线，包被有抗免疫球蛋白抗体，能检测标记胶体金的免疫球蛋白抗体。

吸附区将加样区和反应区层析扩展上来的剩余免疫胶体金颗粒吸附于其中，以提供层析的动力。

3、方法：

取少量血痕样本用蒸馏水浸泡，使浸泡夜微带黄色。

取出试纸条，在加样区（S）加3～5滴浸出液或将试纸条的加样区（S）浸于待检样本的浸泡液中5～10s，静置3～5min观察结果：

反应区中的检测线（DetectionLine）和质控线（Qualitycontrolline）出现两条红色区带为阳性结果。

只有质控线显现红色区带为阴性结果，无带出现表明可能操作失误或试纸条失效，应重复测试。

（三）其它方法

1、间接酶联免疫吸附试验（自学）

2、DNA检验（结合各基因检测结果图，简述）

根据Alu序列作种属鉴定；根据28SrRNA序列鉴定种属；细胞色素b基因序列进行种属鉴别；根据SON基因3’非编码区序列鉴定种属。

时间：

5min

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第六节血痕的个人识别（概述）

检材确证为人血后，应测定血痕中的遗传标记进行个人识别（Afterconfirmthebloodishumanblood,personalidentificationshouldproceed.）。

选择血液遗传标记应遵循以下原则：

①具有良好的遗传多态性，②较稳定，③检测方法已标准化、简便快速、结果重复性好。

目前检测血痕遗传标记的主要障碍是血痕质量问题，当检材保存不当或被水浸，其中的蛋白质和DNA严重降解，遗传标记被破坏；或有大量真菌或细菌生长，会丧失分型检测的条件。

（Thebloodgeneticmarkermusthavegoodgeneticpolymorphisms,stable,andcanbetestwell.）

一、血痕的血型测定（ABOtyping）

ABO血型抗原对高温、腐败有相当的耐受性，而且抗原性很强、稳定，可以在血痕中保存相当长时间。

ABO血型物质不仅红细胞上有，其他人体组织细胞也存在ABO抗原，这些特征在法医物证检材的个体识别中具有重要实际意义。

ABO血型是法医物证检验中个人识别的传统检测项目。

血痕红细胞血型测定方法与临床血型测定不同，常用方法有吸收试验，解离试验等。

时间：

15min

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（一）吸收试验（absorptiontest）

1、原理★：

血痕中A、B、H血型物质。

能与相应的抗-A、抗-B、抗H抗体发生特异性的结合，使抗血清中的游离抗体减少或消失，不能再与相应的A、B、O型指示红细胞发生凝集反应。

若血痕中无某种ABH抗原，则不能抑制抗血清中的相应抗体，抗体与相应的指示红细胞会发生凝集反应，其反应的强度没有变化。

根据抗血清在与血痕吸收反应前后的效价改变情况，可推断血痕所含的血型抗原种类，判断血痕的ABO血型（Accordingtotheantiserumtiterchangebeforeandafterthereactionwithbloodabsorption,confirmtheABOtypeofthebloodstrain.）。

2、方法（幻灯示吸收试验示意图）：

取血痕3块，大小1cm×0.5cm，剪碎，置于试管中，分别加效价为16-32的抗-A、抗-B、抗-H血清各0.1ml。

与检材充分混合后，置4℃冰箱吸收12～24h。

离心取上清液测定吸收后的抗体效价。

以检材无血痕部份作为阴性对照，用已知人A、B、O型血痕作为阳性对照。

3、结果判断：

检材无血痕部份吸收后抗体效价不降低，而待测血痕吸收后抗体效价比空白检材低3级或3级以上为阳性。

综合抗-A、抗-B及抗-H血清试剂吸收的级数，判断血痕中所含的ABH抗原，确定血痕的ABO血型。

4、评价：

吸收试验是测定血痕ABO血型抗原的经典方法，结果稳定可靠，但是要求检材量较多。

检材太少，易出现假阴性结果。

吸收试验的抗血清效价宜用16～32，若检材量少和陈旧血痕，抗血清效价宜用8～16。

抗血清效价太高，可能被抗原吸收不全，导致假阴性。

有些血痕基质对抗血清试剂有非特异性吸收作用，

试验时必须取无血痕部位基质作对照。

时间：

15min

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（二）解离试验（elutiontest）

1、原理★：

血痕中的Ａ、Ｂ、Ｈ抗原能与相应的抗-Ａ、抗-Ｂ、抗-Ｈ抗体发生特异性的结合反应。

这种特异性结合是可逆的，56℃加热后，血痕上抗原结合的抗体可以解离下来。

用已知的A、B和O指示红细胞检测解离液中抗体。

红细胞出现凝集者为解离试验阳性，红细胞不凝集者为解离试验阴性。

综合反应结果，可判断血痕的ABO血型（幻灯示显微检测图）。

（Usethereversibilityofthecombination,testthedissociativefluidwithknownantigentoconjecturethetype.）

2、方法（幻灯示解离试验示意图）：

剪取血痕纤维3段，长各0.5cm，甲醇固定10min，挥干后分别置3支小试管中，分别加效价为64的抗-Ａ、抗-Ｂ、抗-Ｈ血清，室温放置30-60min。

生理盐水洗涤数次，分别加0.1%浓度的A、B和O指示红细胞悬液１滴，置于56℃温箱5-10min后，除去血痕纤维，悬液稍离心，倾倒于载玻片上，镜检。

3、结果判断：

镜下红细胞凝集者为阳性反应；不凝集者为阴性反应。

以检材无血痕部分作为阴性对照，已知Ａ、Ｂ、Ｏ型血痕作为阳性对照。

只有当对照的结果正确时，才能对检材的结果作出判断（幻灯示结果判断表）。

4、评价：

解离试验的特点是：

①实验灵敏度高，检材用量少，适用微量血痕的血型测定；（Highsensitivity）②实验所需时间较短，实验所需设备简单。

③实验操作技术和经验要求较高，其中洗涤步骤是关键，洗多容易出假阴性；洗少容易出假阳性结果。

④抗体效价应高于64。

⑤必须设置已知A和B型血痕对照。

选择对照血痕时应注意与检材血痕浓度相当、时间相近、基质相同。

时间：

10min

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（三）血痕其它遗传标记的检测（简）

1.血痕的血清型测定；

2.血痕的红细胞酶型测定；

3.血痕的DNA分析

血痕的DNA分析目前已成为常规技术，技术的关键在于DNA的提取。

从血痕中提取DNA的方法主要采用有机溶剂提取和Chelex-100提取方法。

有机溶剂法提取的DNA纯度较高，Chelex-100提取方法比较简单，提取模板DNA纯度较差，仅适用于PCR。

血痕及其它法医物证检材中常有杂质存在，可抑制PCR扩增。

常见的杂质有深色染料、苯胺染料及正铁血红素等。

（三）血痕的性别鉴定（简）

DNA分析是目前主要鉴别血痕性别的方法，包括：

Y染色体特异性探针杂交技术、Y染色体特异性酶切片段、PCR扩增Y染色体特异性片段、PCR扩增X、Y染色体特异性片段等。

时间：

5min

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（－）不是血痕，

或已破坏

血型及蛋白质遗传标记测定

血型：

ABO等

血清型：

Hp等

酶型：

PGM1等

DNA遗传标记测定

长度多态：

STR、VNTR

序列多态：

SNP，mtDNA

出血者性别

出血量

出血时间

出血部位等

其它检验

个人识别

（＋）肯定是人血

（－）不是人血

种属鉴别

（＋）肯定是血痕

（－）不是血痕，量太少或已破坏

确证试验

（＋）可能是血痕

预试验

肉眼观察

课堂小结（图）

十一、课堂总结

法医学实际工作中遇见的绝大多数是血痕，而不是新鲜血液。

血痕越陈旧，检验越困难。

血痕检验的目的是解决：

可疑斑痕是否血痕？

是人血还是动物血？

检测血型及其它遗传标记进行个人识别以及血痕的性别、出血量、出血时间及出血部位推断等其它检验。

血痕检验的一般顺序为1、肉眼观察；2、预试验；3、确证试验；4、种属鉴定；5、遗传标记测定。

根据肉眼观察以寻找可疑斑痕，观察其大小形状；预试验和确证试验证实是否血痕；种属鉴定鉴别是人的血痕还是动物血痕；检测血型等遗传标记进行个人识别。

必要时做出血时间、出血量、出血者性别等测定。

通常都照这一顺序逐项进行，否则不但可能浪费时间和精力，还可能得出错误的结论。

如何进行上述检验？

这些检验的价值如何？

有何实际意义？

这些问题希望同学们能够结合在见习、实习中所遇到的案例进行思考。

十二、课后预习内容安排

精液斑检验

十三、课后辅导内容的准备

血痕检验的各种方法及结果评价；

血痕检验在实际案例中的引用。