海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能张鸿鑫图文精.docx

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海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能张鸿鑫图文精

第3期

2016年3月

高分子学报

ACTAPOLYMEＲICASINICA

No．3Mar．,

2016368

*2015-08-24收稿,2015-10-13修稿;广东省自然科学基金（基金号2014A030313379和国家自然科学基金（基金号81171459,31400824资助．

**通讯联系人,

E-mail:

tlulu@jnu．edu．cn;tcrz9@jnu．edu．cndoi:

10.11777/j．issn1000-3304.2016．15211

海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能

*

张鸿鑫

1

鲁路

1,2**

李立华

1,2

焦延鹏

1,2

周长忍

1,2**

（1暨南大学材料科学与工程系

2

人工器官与材料教育部工程中心广州510632

摘

要

利用高碘酸钠氧化海藻酸得到带有醛基的海藻酸,利用水合肼与聚乙二醇反应得到末端为酰肼基

的聚乙二醇,以二者为原料利用醛基与酰肼基反应形成酰腙键的动态化学反应,赋予天然生物大分子水凝胶优良的自愈性和pH响应性．通过红外光谱、核磁共振光谱、动态黏弹谱、电子万能试验机等表征了材料的结构、水凝胶的自愈合能力以及pH响应性．结果表明,该水凝胶具有良好的力学性能和自愈合能力,能够在不加热和不添加催化剂的情况下,在温和的生理环境下自发实现切口愈合．同时水凝胶具有pH响应性,在碱性环境中成凝胶,在酸性环境中则转变为溶液状态,并且这种凝胶—溶液转变可重复多次．这些优异的性能,加上简单的制备方法、良好的生物相容性将为这类材料在生物医用领域的应用提供坚实的基础．关键词

海藻酸,水凝胶,自愈合,酰腙键

海藻酸是从天然褐藻中提取的一种多糖,

结构为直链型（1→4键合的β-D-甘露糖醛酸（M和α-L-古洛糖醛酸（G的无规嵌段共聚物,其中

G单元是M单元在C-5位的立体异构体[1]．海藻酸钠水溶液在遇到钙、铜、锌等二价金属阳离子（镁除外时,能够在温和的生理条件下迅速形成

凝胶,因此被广泛应用于药物载体[2]、组织工程

支架[3]、细胞微囊化免疫隔离技术[4]

等生物医

用

[5,6]

领域．在多价离子与海藻酸形成的水凝胶

中,以钙-海藻酸凝胶研究得最多．作为细胞外基质,钙-海藻酸水凝胶能够为细胞生长提供三维生长环境,但由离子螯合形成的物理交联是可逆的,

组织液中大量的Na+

、

K+等离子能逐渐与高价离子发生置换,导致水凝胶力学强度降低[7]

较高

的Ca2+

离子浓度也会影响细胞的生长,导致细胞

毒性,触发细胞凋亡或细胞死亡[8]

．近年来研究者尝试利用多种形式的化学交联来制备具有多种功能的海藻酸水凝胶以满足其在生物医用领域的要求．海藻酸钠与甲基丙烯酸酐反应可制备光交联海藻酸水凝胶,通过调节海藻酸中甲基丙烯酸酯的含量,能够控制凝胶的溶胀率、弹性模量和降解速率

[9]

．Balakfishnan等采用高碘酸钠使海藻酸

钠部分氧化得到含醛基的海藻酸钠,利用Schiff

碱反应,与含有大量氨基的明胶混合交联形成可

原位成型的凝胶体系[10]

．Sun等利用海藻酸和聚丙烯酰胺构建了具有高拉伸和高韧性的双网络水

凝胶[11]

．

自愈合是活体组织的基本性能之一,

生物组织受损之后会发生高效而复杂的自愈合过程,并可承受反复的伤害．把生物学的概念引入高分子材料,形成具有自愈合功能的智能型材料称为自

愈性材料[12]

．将自愈性这一特点引入生物医用水凝胶,具有重要的仿生意义,自愈性水凝胶能够更

好的满足可注射水凝胶的要求,在注射过程中被

破坏的结构可在生物体内重建．另外,自愈性水凝胶作为三维细胞培养载体有着独特的优势,能够更好地模拟细胞生存环境,有助于细胞间的接触信息传递,实现多种、多层细胞的共培养等．酰腙键

[13,14]

是当前动态化学领域备受关注的一种可逆共价化学键,通过它制备的凝胶不但具有良好

的稳定性,而且由于酰腙键在酸催化下的反应是

一个可逆反应[15,16]

因此有望制备同时具有pH响应特性及自愈性的水凝胶．本研究利用生物相

容性优良的生物大分子海藻酸和聚乙二醇（PEG作为主要原料,使用高碘酸钠氧化海藻酸制备了含有醛基的氧化海藻酸（ADA,并通过水合肼与

3期张鸿鑫等:

海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能

聚乙二醇反应,得到末端为酰肼基的聚乙二醇（PEG-DF,进一步利用醛基与酰肼基反应形成酰腙键,赋予海藻酸水凝胶自愈性和pH响应性,为该类材料在生物医用领域的应用奠定了基础．

1实验部分

1.1主要原料

海藻酸钠,食品级,青岛晶岩生物科技开发有限公司（粒度为60目,黏度为530MPa·s;PEG2000,天津市大茂试剂厂;其他试剂如未做特殊说明,均为分析纯,购自广州化学试剂厂．1.2部分氧化海藻酸的制备与表征

强氧化剂高碘酸钠可以氧化邻二醇结构,使其成为醛或酮,海藻酸钠与高碘酸的反应式如示意图1所示．将5g海藻酸钠均匀分散于25mL无水乙醇中,将2.7g高碘酸钠溶于25mL去离子水中制成溶液并加入到海藻酸钠分散液中,避光条件下磁力搅拌6h,加入与高碘酸钠等物质的量的乙二醇终止反应,继续搅拌1h．反应产物在去离子水中透析（透析袋截留分子量800014000,每4h换水,直至去离子水的电导率不再发生变化,－40ħ下冷冻干燥得到ADA样品

．

Scheme1Oxidationofalginate

取制备的ADA少量,KBr压片法制样,使用

德国Bruker公司EQUINOX55型傅立叶变换红外

光谱仪对产物进行红外光谱分析．

利用盐酸羟胺-电位滴定法测定醛基含

量[17],具体方法如下:

利用盐酸羟胺与醛基反应

生成肟,同时释放HCl,配制一定浓度的NaOH溶

液,对释放出的HCl进行滴定．实际氧化度（OD

定义为被氧化的糖醛酸单元占海藻酸中所含糖醛

酸单元的比例,如式（1所示．

OD=

n

CHO

/2

n

hexuronicacids

ˑ100%（1

其中nCHO为盐酸羟胺-电位滴定法测定的醛基的

物质的量,nhexuronicacids为试样中所含的糖醛酸单元

的物质的量．

1.3末端为酰肼基的聚乙二醇的合成与表征

PEG-DF的合成反应如示意图2所示,参考

文献[18]的方法,具体操作步骤如下:

首先将

5.24gPEG2000溶解在90mL无水甲苯中,加入

17mL溶解了1.8g叔丁醇钾的叔丁醇溶液,充分

混合后,通入氮气20min．然后,将3.2mL溴代乙

酸乙酯逐滴滴加到溶液中,室温下搅拌24h,过滤

除去副产物,将滤液旋蒸浓缩,在冰乙醚中沉淀,

得到白色沉淀的中间产物．第二步,将5g中间产

物溶于100mL甲醇中,然后缓慢加入水合肼的甲

醇溶液（30mL水合肼溶于40mL甲醇中．室温

下搅拌24h,旋蒸浓缩,将浓缩液用二氯甲烷萃

取,萃取液用无水硫酸镁干燥过夜．过滤浓缩后,

在冰乙醚中沉淀,得到PEG-DF产物

．

Scheme2SynthesisofPEG-DF

将PEG-DF溶于氘代二甲基亚砜,置于核磁

管中,使用德国Bruker公司ascendTM500型核磁

共振光谱仪对PEG-DF结构进行分析表征．

1.4水凝胶的制备与表征

将ADA与PEG-DF分别溶于PBS缓冲液

（pH=7.4中形成均相溶液,将两种溶液直接漩

963

高分子学报2016年

涡混合均匀（如未特别注明,体系中醛基和酰肼基摩尔比5ʒ2,室温下即可形成均匀透明的水凝胶．

水凝胶的自愈合性表征采用模具制备2组圆柱形水凝胶（直径（10ʃ1mm,高（8ʃ1mm,其中一组添加少量罗丹明B（20μL,5mg/mL染色．将3个圆柱形水凝胶首尾相接,在接界处滴加20μLPBS用于润湿表面,将拼接好的凝胶室温下放置12h后,观察水凝胶自愈情况．同时用原位释放的方法[19]

制备钙离子交联的海藻酸水凝

胶作为对照组．

水凝胶的动态黏弹性测试使用Kinexuspro

旋转流变仪（MalvernInstruments,UK,所用夹具为平板,直径40mm,试验温度25ħ,夹具边缘用

硅油密封以防止水分挥发．利用动态黏弹谱跟踪体系的自愈合过程步骤如下:

将两组份混合均匀后置于平板夹具上,利用时间扫描跟踪凝胶化过程,当体系的模量不再变化,说明交联完全并形成稳定的三维网络结构;然后打开夹具将水凝胶切成16等份,并滴加20μLPBS（pH=6润湿切面,重新合上夹具,一定时间后对样品进行动态频率扫描．

压缩和拉伸试验使用SHIMADZUAG-I型高精度电子万能试验机进行．压缩试验试样为圆柱形,直径（10ʃ1mm,高（8ʃ1mm,压缩速率1.0mm/min．使用手术刀片将圆柱型水凝胶纵切成4等份,在切口处滴加20μLPBS（pH=6润湿切面,一定时间后进行同条件压缩测试．拉伸试验采用哑铃型样条,标距15mm,横截面2mmˑ4mm．拉伸速率1.0mm/min．使用手术刀片将哑铃型水凝胶从标距中心位置切开,在切口处滴加20μLPBS（pH=6润湿切面,一定时间后进行同条件拉伸测试．

2

结果与讨论

2.1

氧化海藻酸的表征

海藻酸钠的糖醛酸结构单元中具有顺式邻二

醇结构,因而能与高碘酸钠反应,发生C—C键断裂,生成2个醛基．这个反应是定量进行的,每断1mol碳-碳键消耗1mol高碘酸钠,因此可以通过控制高碘酸钠的量来控制海藻酸钠的氧化度．氧

化前后海藻酸钠样品的红外光谱图如图1所示,

氧化海藻酸在1731cm－1

处出现了1个新的特征峰,该峰应归属于醛基的CO振动吸收峰,醛基

的另一特征峰v（CO—H在2855cm－1

出现．因

此可以证明通过高碘酸钠氧化我们得到了醛基化的海藻酸钠．利用盐酸羟胺-电位滴定法测定的醛基含量为4.91mmol/g,计算得到海藻酸钠的实际氧化度为48.6%．海藻酸被氧化后顺二醇结构转化为醛基,糖环打开,此时原糖醛酸上的C（1结构成为同碳二元醚,可将其看作类似缩醛的结构,而缩醛结构容易发生水解,因此部分氧化海藻

酸钠可按照类似缩醛的水解机理降解[20]

．氧化海藻酸不仅引入了醛基,也解决了海藻酸在体内难以降解的问题．2.2

末端为酰肼基的聚乙二醇的表征PEG-DF的1H-NMＲ谱图以及各个峰的归属

如图2所示,在δ=8.89处,出现1个—CO—

NH—小而尖的单峰,在δ=4.504.64处,出现1个—NH2—的小而宽的峰,根据d、

b、

c3处的积分面积,计算得到PEFG-DF的酰肼基封端率为96.6%（ScʒSbʒS

d=1ʒ1.94ʒ2.07

．

Fig．1IＲspectraofsodiumalginatewithandwithout

oxidization

Fig．2

1

H-NMＲspectrumofPEG-DFinDMSO-d6

73

3期张鸿鑫等:

海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能

2.3水凝胶的形成

水凝胶的形成过程是酰肼和醛基发生反应形成酰腙交联点并逐渐形成网络结构的过程,凝胶结构形成示意图如图3所示．ADA上的醛基与PEG-DF上的酰肼基能够形成酰腙键,酰腙键在动态共价化学交联中属于结合较稳定的一类,可以在中性或者碱性的水溶液中稳定存在,在酸性溶液或者在高温催化下,酰腙键的水解和转胺速率会得到显著的提高[21]．

利用动态黏弹谱跟踪了体系的凝胶化过程

Fig．3Schematicillustrationoftheself-healinghydrogelbasedonreversiblecovalentacylhydrazonebond

结果如图4所示．在2组份混合初始阶段,体系的

损耗模量大于储存模量,呈现出黏弹性液体的行

为．随着时间延长,弹性的贡献逐渐超过黏性的贡

献,体系发生了凝胶化,形成了贯穿整个体系的三

维交联网络结构．随着体系中固含量的增加,体系

的凝胶化时间缩短,当体系中固含量为18%时

（ADA6wt%,PEG-DF12wt%,凝胶化在1min

内完成,而当体系中固含量为9%时（ADA

3wt%,PEG-DF6wt%,凝胶化则需要20min以

上．因此可以通过控制体系中ADA和PEG-DF的

浓度来调控凝胶化时间．不同固含量水凝胶的动

态频率扫描结果如图5所示,随着体系中固含量

增加,体系的交联网络密度增加,储能模量逐渐增

大．样品在较宽的频率范围内,储能模量不依赖于

频率变化,证明体系形成了稳定的凝胶网络结构．

当固含量达到12%（ADA4wt%,PEG-

DF

Fig．4TimedependenceofstoragemodulusG'（solidand

lossmodulusG!

（hollowforthehydrogelsamplesduringthe

gelationprocesswithindicatedsolidcontentat25ħ（frequency

1.0Hz;strain1.0%

8wt%以上时,提高体系浓度对水凝胶模量提高

173

高分子学报2016年

的影响逐渐减弱

．

Fig．5

AngularfrequencydependenceofstoragemodulusG'

（solidandlossmodulusG!

（hollowforthehydrogelsampleswithindicatedsolidcontentat25ħ（strain1.0%

2.4水凝胶的自愈性

酰腙键在酸催化下的反应是一个可逆的反

应,因此在形成的凝胶中必然存在着动态的交换

性,酰腙键的动态平衡性具有可逆交换速度快、可逆反应条件温和、可逆反应可控的特点,基于这些性质我们考察了水凝胶的自愈合能力．图6显示了水凝胶的自愈合情况,将不同颜色的水凝胶拼接、放置12h后,对ADA与PEG-DF形成的水凝胶（图6（a6（c施加弯曲、拉伸等应力,凝胶接界处未产生断裂情况,说明水凝胶实现了自愈合,且能够承受一定的外力;而相同条件下海藻酸

钠与Ca2+

形成的水凝胶（图6（d6（f无法实现自愈合．

进一步利用动态黏弹谱跟踪了体系的自愈合过程,为了检测凝胶切口是否愈合,我们采用了较

大的应变值Strain=20%测定体系的储存模量,为了避免大应变对自愈合过程和动态模量测试带来的影响,对样品进行了一定时间点的频率扫描,结果如图7所示,随着愈合时间的延长,储存模量逐

渐增大,2h后水凝胶的储存模量恢复到原始模量的90%以上

．

Fig．6Digitalphotographsshowtheself-healingpropertiesofhydrogels:

（a－cADAandPEG-

DFhydrogeland（d－fCa2+crosslinkedalginate

hydrogel

Fig．7Ｒheologicalcharacterizationoftheself-healingprocessat25ħ（12wt%solidcontent,strain20%

2

73

3期张鸿鑫等：

海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能373体系愈合过程中，宏观力学性能也随之发生改变，利用电子万能试验机测定了水凝胶在愈合过程中的压缩和拉伸曲线，结果如图8所示．图8（a）是压缩应力应变曲线，接触愈合4h后，水凝胶已部分愈合，最大压缩应变达60%，最大压缩应力约50kPa，随着接触愈合时间的延长，凝胶逐渐恢复，当愈合时间达到24h时，水凝胶的压缩力学性能基本恢复到原始水平．图8（b）是拉伸应力应变曲线，随着愈合时间的延长，拉伸应力和24h拉断应力恢复到原始拉断伸长率逐渐恢复，水平的90%．接触面的湿润的环境为水凝胶的愈合面提供了空间，保证了断面的充分接触，另外弱酸性环境为酰腙键的打开/结合提供了有利条件，使得凝胶快速愈合恢复成为可能．Fig．8Stressstraincurvesforthehydrogelduringtheselfhealingprocess（a）Compressivestressstraincurvesforsampleswith12%solidcontent（b）Tensilestressstraincurvesforsampleswith18%solidcontent2.5凝胶的pH响应性酰腙键的形成和断裂在室温下的酸催化过程是可逆的，因此可以通过调控环境的pH值来实现体系的凝胶和溶液转变．如图9所示，在氧化海20L，藻酸水凝胶中加入μ冰醋酸漩涡震荡，此时体系pH约为3.5，凝胶逐渐转变为溶液；当凝胶完全变成溶液后，向其中再加入25μL三乙胺，体系pH约为7，放置5～10min，体系再次形成稳定凝胶．这种pH诱导的凝胶溶液转变是可逆的，可多次反复进行．但是伴随着凝胶溶液转变次数的增加，醋酸和三乙胺的加入量增加，体系中高分子浓度降低，离子强度增大，最终不再对加入的酸碱做出响应．体系能够实现的凝胶溶液转变次数与DF的浓度相关，氧化海藻酸和PEG当体系中固含量为6%时，能够实现2次凝胶—溶液转变，当体系中固含量达到18%时，可实现9次凝胶溶液转变．Fig．9StoragemodulusofthesamplesunderrepeatedprocessbyadjustingpH（originalhydrogelswith12wt%solidcontent）溶胶转变可逆性，而且可以在不物理凝胶的凝胶加热和催化剂的情况下，在温和的生理条件下自发实现切口愈合，是一种真正意义上的自愈合材料．该水凝胶以具有良好生物相容性的海藻酸和PEG为主要原料，有望作为可注射的组织工程支架材料和药物控释材料，另外良好的自愈性能为该类材料在多层细胞的三维培养方面奠定了良好的基础，为研究细胞与材料，细胞与细胞间的相互作用以及功能化的组织工程支架的构建提供了良好的载体．3结论本研究通过高碘酸钠氧化海藻酸得到带有醛基的海藻酸，通过水合肼与聚乙二醇反应得到末端为酰肼基的聚乙二醇，以二者为原料，利用酰腙键动态平衡的特性，赋予天然大分子水凝胶优良的自愈性能以及pH响应性．该水凝胶不仅具有

374高分子学报2016年ＲEFEＲENCES123456789101112131415161718192021BoontheekulT，KongHJ，MooneyDJ．Biomaterials，2005，26：

2455～2465MartinMJ，CalpenaAC，FernandezF．CarbohydPolym，2015，117：

140～149DruryJL，MooneyDJ．Biomaterials，2003，24：

4337～4351ChayosumritM，TuchB，SidhuK．Biomaterials，2010，31：

505～514BensonK，GallaHJ，KehrNS．MacromolBiosci，2014，14：

793～798PeppasNA，BuresP，LeobandungW．EurJPharmBiopharm，2000，50：

27～46MoshaveriniaA，ChenCD，AkiyamaK．JBiomedMaterＲesA，2013，101：

3285～3294OrreniusS，ZhivotovskyB，NicoteraP．NatＲevMolCellBio，2003，4：

552～565JeonO，BouhadirKH，MansourJM．Biomaterials，2009，30：

2724～2734BalakrishnanB，JayakrishnanA．Biomaterials，2005，26：

3941～3951SunJY，ZhaoXH，IlleperumaWＲK．Nature，2012，489：

133～136WuDY，MeureS，SolomonD．ProgPolymSci，2008，33：

479～522LehnJM．ProgPolymSci，2005，30：

814～831LehnJM．ChemSocＲev，2007，36：

151～160HanXJ，DongZQ，FanMM．MacromolＲapidComm，2012，33：

1055～1060DingFY，WuSP，WangSS．SoftMatter，2015，11：

3971～3976ZhaoH，HeindelND．PharmＲesDordr，1991，8：

400～402XueJ，JiaZF，JiangXL．Macromolecules，2006，39：

8905～8907QuB，ChenCS，QianLY．MaterLett，2014，137：

106～109BouhadirKH，LeeKY，MooneyDJ．BiotechnolProgr，2001，17：

945～950LiuFY，LiFY，DengGH．Macromolecules，2012，45：

1636～1645AlginatebasedSelfhealingandpHresponsiveHydrogelsFormedbyDynamicCovalentBondingHongxinZhang1，LuLu1，2*，LihuaLi1，2，YanpengJiao1，2，ChangrenZhou1，2*（21DepartmentofMaterialsScienceandEngineering，JinanUniversity，EngineeringＲesearchCenterofArtificialOrgansandMaterials，MinistryofEducation，Guangzhou510632）AbstractAselfhealablehydrogelwas