生物样本中蛋白质的提取及测定分子医学实验.docx
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生物样本中蛋白质的提取及测定分子医学实验
《分子生物学实验》
实验报告
实验名称:
生物样本中蛋白质的提取及测定
姓 名:
陈 杰
学 号:
31４０1０4666
组 不:
同组同学:
唐陈曦
带教教师:
刘伟俞萍
实验日期:
2015年9月15日
1、原理:
3
１、1生物样本中蛋白质的提取ﻩ３
1、2生物样本中蛋白质的测定ﻩ3
1、2、１ Lowry法3
１、2、2考马斯亮蓝法ﻩ3
1、２、3紫外吸收法4
2、操作步骤4
2、1生物样本中蛋白质的提取ﻩ４
2、2、3紫外吸收法ﻩ５
3、实验结果ﻩ5
3、1原始数据５
３、1、1Lowrｙ法ﻩ5
3、1、2考马斯亮蓝法ﻩ6
３、2数据处理ﻩ7
３、2、1 Lowry法７
3、2、2考马斯亮蓝法８
３、２、3紫外吸收法ﻩ9
１、原理:
1、１生物样本中蛋白质的提取
离体不久的组织,在适宜的温度及pH等条件下,能够进行一定程度的物质代谢。
因此,在生物化学实验中,常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用,也能够从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。
但生物组织离体过久,其所含物质的含量与生物活性都将发生变化、例如,组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活;有些组织成分如糖原、ＡＴP等,甚至在动物死亡数分钟至十几分钟内,其含量即有明显的降低、因此,利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时,都必须迅速将它取出,并尽快地进行提取或测定、一般采纳断头法处死动物,放出血液,马上取出实验所需的脏器或组织,除去外层的脂肪及结缔组织后,用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液）,再用滤纸吸干,即可用于实验、取出的脏器或组织,可依照不同的方法制成不同的组织样品、包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。
由于动物肝脏细胞比较脆弱,易于破碎,故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料,采纳匀浆法法将其破碎,然后加入样品提取液使蛋白质溶解,用高速离心法弃去细胞碎片。
收集上清液后可进行蛋白质定量分析。
１、2生物样本中蛋白质的测定
1、２、１ Lowｒy法
１92１年,Folin发明了Ｆoliｎ—酚试剂法测定蛋白质的浓度,反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸与色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸－磷泪酸）生成蓝色化合物;19５１年Lｏｗry对上述方法进行了改进,让蛋白质先与碱性铜试剂进行反应,然后再与酚试剂反应,改进后的方法能够使反应的灵敏度提高。
蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的紫色或紫红色络合物（类似双缩脲反应）。
由于蛋白质中芳香族氨基酸残基（酪氨酸）的存在,该络合物在碱性条件下进而与Foliｎ—酚试剂形成蓝色复合物、上述呈色反应的颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正比、通过与已知含量的标准蛋白质的生色结果进行比较分析,即可检测待测样品的蛋白质含量。
目前实验室常规的快速定量测定蛋白质含量方法中,以Loｗｒｙ等人发展的Foｌiｎ—酣法应用最为普遍。
该方法的优点是:
灵敏度高（比紫外吸收法灵敏度高10〜20倍）,操作简单快速,不需复杂的仪器设备。
１、2、2考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G-２5０染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置,由465nm变为595ｎm,溶液的颜色也由掠黑色变为蓝色。
经研究认为,染料主要是与蛋白质中的械性氨基酸（特不是精氨酸）与芳香族氨基酸残基相结合。
在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈青色,在5９5nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故能够用于蛋白质含量的测定、
1、2、３紫外吸收法
蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸,由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大pｉ键,它们在280nm紫外光附近有光吸收,因而使蛋白质在上述紫外光波长附近产生较强的光吸收,利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。
2、操作步骤
2、1生物样本中蛋白质的提取
1、用颈椎脱白法处死小鼠,切开腹腔,取下完整肝脏,小心去掉胆囊（不要弄破）,放入盛 冷生理盐水的烧杯中漂洗干净、
2、取小鼠肝整个肝组织,在称量纸上剪碎,放入玻璃勾装管中、
3、按１:
15的比例往玻璃勾紫管中加入勾装缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液6ｍL,蛋白酶抑制剂0、16mL）,手动匀浆。
注意用力均勾,以免损坏匀浆管、４、匀浆完成后,取一支２mL eppendorｆ管,各加入1、８ｍL勾衆液后,置入冷冻离心中。
５、５、于４℃,13000r/ｍiｎ离心２０min后,小心取出上清液0、5ml至２mLeppｅndorf管中,加入0、5ｍｌ缓冲液,用于蛋白质含量的测定,再取出上清液0、5ml至另一2mLeppｅｎｄorf管中－2０℃保存。
２、2生物样本中蛋白质的测定
2、2、1Lｏwry法
1、取１6ｍmxl50ｍm试管16支,标号,放置在试管架上,在1〜６号试管内分不加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0、5ｍg／ＭL）0、0、1、0、2、0、3、０、4、0、5ｍL,用双蒸水补足至每管总体积０、５ｍL,在7、８号试管内分不加入待测样品25、50uL,并用双蒸水补足至0、５ｍL（马上待测样品稀释20或10倍）。
9〜16管作为平行实验管重复１〜8管的操作并同时进行实验,取算术平均值作为检测结果。
２、各管加入2、5mL新配制的碱性铜溶液,马上摇匀,在室温下放置1０ｍｉn、
3、各管加入0、５ｍL Ｆｏlｉｎ–酚试剂应用液,边加入边马上充分混合（用振荡混合器）,然后在室温下放置３0〜６0ｍiｎ（不要超过60min）。
4、分不用1号与9号管作为空白对比调零,检测其余标准样品管及待测样品管在55０ｎｍ波长处的吸光度值。
5、依照已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线,然后依照待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。
依照稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。
2、2、2考马斯亮蓝法
1、取16ｍmx150ｍｍ试管16支,标号,放置在试管架上,在1〜6号试管内分不加入标准牛血清白蛋白（使用时取e液用双蒸水稀释至０、５ｍg/mL）0、0、０2、0、０4、0、０６、0、08、０、1mＬ,用双蒸水补足至每管总体积０、1mL,在７、８号试管内分不加入稀释2０、10倍的待测样品０、1mL、9〜１6管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验,取算术平均值作为检测结果。
2、每管加入考马斯亮蓝G-250染料试剂3mL,摇勾,室温静置３mｉｎ
3、分不用1号与9号管作为空白对比调零,检测其余标准样品管及待测样品管在５９５nm 处的吸光度值。
４、依照已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线,然后依照待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。
依照稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量、
２、2、3紫外吸收法
1、取16ｍmx150mm试管１6支,标号,放置在试管架上,在1〜6号试管内分不加入标准牛血清白蛋白（2mg／mL）0、0、3、0、45、0、6、0、75、0、9mＬ,用双蒸水补足至每管总体积3ｍL,在７,８号试管内分不加入稀释１00,50倍的待测样品3mL、9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验,取算术平均值作为检测结果。
２、分不以１号管与９号管作为空白对比调零,用紫外分光光度计（注意用石英比色杯）于波长280nｍ处比色,记录各管的吸光度值。
３、依照已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线,然后依照待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量、依照稀释倍数计算小鼠肝提取液的蛋白质含量、
3、实验结果
3、1原始数据
3、1、１ Ｌowry法
序号
１
2
3
４
５
6
7
8
牛血清蛋白浓度（mｇ/mL）
0
0、１
0、2
0、3
0、4
0、５
一号组吸光度值
0
0、182
0、304
0、400
0、45４
０、４84
０、323
0、519
二号组 吸光度值
0
0、１6９
０、303
０、３92
0、443
０、495
0、342
0、517
算术平均值
0
0、175５
0、3０35
0、396
0、4485
0、４８95
0、3325
0、５18
3、1、2 考马斯亮蓝法
序号
1
2
３
4
5
６
7
8
牛血清蛋白浓度（mg/ｍL）
0
0、1
０、２
0、３
0、４
0、５
一号组 吸光度值
0
０、１43
0、262
0、35３
0、41９
0、５70
0、4０９
0、739
二号组吸光度值
0
０、１5５
0、２84
0、3６7
0、５22
0、5７9
０、４12
0、780
算术平均值
0
０、149
0、２73
0、36０
0、４７0５
０、５745
０、4105
0、7５9５
３、1、3紫外吸收法
序号
1
2
3
４
5
６
7
８
牛血清蛋白浓度（ｍg/mＬ）
０
0、2
０、３
0、4
0、5
0、6
一号组吸光度值
０
０、１３3
0、197
0、２５6
0、32４
0、380
0、229
0、４05
二号组 吸光度值
0
0、116
0、1９7
０、２55
0、316
0、３84
0、2００
0、40８
算术平均值
0
0、1245
0、19７
0、2555
０、32０
0、38２
０、2145
0、40６5
3、2数据处理
3、2、１Loｗry法
将ｙ=０、3325代入拟合出的直线:
ｙ=0、95971x+0、０６2２4中可得浓度为0、2８mg／ mL,原样品中蛋白质浓度为5、６ｍg／mＬ,则原来的浓度为11、2mｇ/mL。
将ｙ＝0、51８代入拟合出的直线:
y=0、95971x+0、06224中可得浓度为0、48ｍg／mＬ,则原样品中蛋白质浓度为4、８mg/mL,则原来的浓度为9、６mg/ｍL、
取平均值为１０、4ｍg/ｍL。
3、２、２考马斯亮蓝法
将ｙ＝０、41０5代入拟合出的直线:
y=1、1２１1４x＋0、０２4２１中可得浓度为０、34mg/ｍL,则样品中蛋白质浓度为6、8mｇ／ｍL,则原来的浓度为13、６mg/ｍL、
将y＝0、75９5代入拟合出的直线:
y=1、12114x+０、0２421中可得浓度为0、66mg/mＬ,则样品中蛋白质浓度为６、６mg/ｍL,则原来的浓度为13、２ｍg/mＬ。
取平均值为13、４mg/mL。
３、2、３紫外吸收法
将y=0、２145代入拟合出的直线:
ｙ＝0、６３886x+0、0０021中可得浓度为0、34mg／ｍL,则样品中蛋白质浓度为6、８mg/mL,则原来的浓度为13、6mｇ／mＬ、
将y=０、40６５代入拟合出的直线:
y=0、6３８86x＋0、00021中可得浓度为０、6４mg／ｍL,则样品中蛋白质浓度为6、４mｇ／mL,则原来的浓度为12、8 mg／mL、
取平均值为１3、2mｇ/ｍL。
4、讨论:
依照三种方法得出蛋白质的浓度约为13、3mｇ／ｍＬ（没有算第一种方法得出的结果,因为方法一中的R—squaｒe值只有0、916９）,从后两种方法的回归线中能够看出依然特不符合实验规律的、依照实验经历与实验结果,我更喜爱第二种方法、我们在选择方法的时候主要考虑:
①实验对测定所要求的灵敏度与精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。
其中Loｗrｙ灵敏度高,不需要复杂仪器,但反应需要的时间较长,操作的用时也有比较高的要求,同时容易受到非蛋白质的影响,例如含有ＥDTA,甘氨酸等物质的蛋白就不适合这种方法。
之因此第一组数据尤其不准,我想与我们组的操作水平不无关系,因为Folin—酚试剂只有在酸性条件下稳定,但还原反应只在碱性条件下发生,因此加入的时候要马上混匀,估计这个没有做好,另外就是实验室里分光光度计调整用了好久。
再就是考马斯亮蓝法,灵敏度高,测定简便,只要加一种试剂,而且染料的颜色能够在较长时间内保持稳定。
我们组做实验的时候是先一起做完Loｗry法与考马斯亮蓝法之后去测定的,而调整分光光度计用时了特不久,因此这种方法即时过了一段时间,测出来的数据也还特不准,不用像Lowｒy法那样费时与严格地控制时间、同时该法干扰物质特不少,像Ｋ+,Na+,Mｇ+离子,EDＴA等等的都不干扰、使用过考马斯亮蓝染液的比色杯比较难清洗,能够用乙醇脱色后再用清水清洗,注意少量多次、
最后是紫外吸收法,相关于前两种方法最大的优势就是速度特不快,操作特不简单,也不需要消耗样品,测定后能回收使用、假如要测定来源比较珍贵的,不容易获取的蛋白质浓度能够考虑这种方法、只是也有特不多缺点,例如准确度较差、假如样品中有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰,同时敏感度也比较低,对蛋白的浓度要求较高、注意测试时必须使用石英比色杯。
同时有几点要注意的就是抓小鼠时千万小心不被咬伤与抓伤,抓取小鼠时注意不要被抓伤或咬伤。
手握尾巴１/３处,脊椎脱臼时快速准确以减轻小鼠的痛苦。
剪开腹腔取出肝脏后,我们组漂洗得不够充分,血液有些残留,导致用玻璃匀浆器研磨后的匀浆的颜色偏红、尽管经过离心后,颜色变为微黄透明,对后续吸光度的测定影响不大、然而由于血细胞的残留,估计导致血细胞也被研磨破碎,其中的蛋白质进入溶液,使整体蛋白质浓度升高。
总结实验,还有我们做的比较好的就是,在及时用冰保持在4℃条件下匀浆,我们组还注意到手持匀浆管的时候幸免了体温的影响,抓住匀浆管上部进行操作的。
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