基因工程实验报告.docx

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基因工程实验报告

、

小麦GAPDH截短体的重组与表达

摘要：

本实验通过基因工程（geneticengineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。

通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。

关键字：

小麦基因；载体；感受态

前言

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。

为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

它克服了远缘杂交的不亲和障碍。

（一）实验过程

1.实验部分流程：

2．小麦总RNA提取（Trizol法）

2.1材料

小麦幼苗

2.2试剂配制及器具处理

①0.1％的DEPCH2O（DEPC：

焦碳酸二乙酯）

②器具处理：

试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPCH2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。

剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。

③无RNA酶灭菌水（DEPCH2O）：

用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

④Trizol

⑤75%乙醇：

用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

⑥氯仿（最好用新的）。

⑦异丙醇（最好用新的）。

2.3操作步骤：

①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。

室温放置10min，12000rpm离心10min。

④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。

⑤重复步骤④。

⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。

用30µLDEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

3.RT-PCR扩增目的基因cDNA

3.1试剂

①RNA模板

②Olig（dT）18

③反转录缓冲液

④dNTP

⑤M-MULV反转录酶

⑥RNA抑制剂（RNasin）

⑦PremixEXTaqDNA聚合酶

⑧PCR特异引物

3.2操作步骤：

3.2.1RNA的反转录

采用ThermoScientific（Fermentas）RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit

TotalRNA

6µL（需加入RNA约1μg）

OligodTprimer

1µL

H2O（nuclease-free）

5µL

12µL

65℃5min，补加下列试剂：

5×Reactionbuffer

4µL

RibolockRNaseInhibitor

1µL

10mMdNTPMix

2µL

RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase

1µL

20µL

42℃60min

70℃，5min，﹣20℃保存

3.2.2PCR扩增目的基因

用表达引物扩增目的基因（25µL体系）

2×PCRMix

12.5µL

95℃1min

35cycles

95℃10s

58℃20s

72℃45s

72℃10min

16℃∞

cDNA

1µL

引物GA22PDH1-1

1µL

引物GAPDH1-2

1µL

H2O

9.5µL

total

25µL

PCR产物经胶回收。

4．核酸琼脂糖电泳分析

4.1试剂

①TAE缓冲液（50×）：

用时需稀释50倍

②点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

含0.25%溴酚蓝和40%甘油

③溴乙啶染色液（EB）：

10mg/ml溴乙啶，注意EB具致癌作用。

④琼脂糖

4.2操作步骤

4.2.1琼脂糖凝胶的制备

称1g琼脂糖加入100mlTAE缓冲液中加热熔化。

4.2.2胶板制备

将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。

然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE缓冲液），拔掉梳子。

注意：

缓冲液要高出胶面2mm。

4.2.3点样

每个样品中加入1/10体积Loadingbuffer（10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。

4.2.4电泳

接通电源，80V电压电泳40min左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2㎝处时停止电泳。

4.2.5观察及照相

将凝胶取出，在EB溶液中浸泡10min后，用凝胶成像系统照相。

5.pGEX4T-1质粒的提取

5.1实验材料

含质粒的大肠杆菌

5.2试剂

质粒提取试剂盒（天根生物科技）

5.3操作步骤

5.3.1培养细菌

　　将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24h，然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃培养12h。

5.3.2提取步骤

1柱平衡步骤：

向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µL的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）

2取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3向留有菌体沉淀的离心管中加入250µL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4向离心管中加入250µL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5向离心管中加入350µL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

6将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将

7吸附柱CP3放入收集管中。

8向吸附柱CP3中加入600µL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9重复操作步骤7。

10将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

11将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100µL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

5.3.3琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

6表达载体和目的片段的酶切

6.1试剂

1BamHⅠ

2SalⅠ

3BamHⅠbuffer

4质粒提取试剂盒

6.2操作步骤

6.2.1在LB液体培养基中接入带pGEX4T-1质粒的菌种，在37℃下200rpm摇菌过夜。

参见实验8的方法提取质粒。

6.2.2质粒DNA和目的片段的酶切

管号

pGEX4T-1

32µL

PCR产物

32µL

ddH2O

10µL

BamHⅠBuffer（10×）

5µL

BamHⅠ

1µL

SalⅠ

2µL

7载体和外源DNA的连接反应

7.1试剂

1目标DNA片段（PCR扩增产物）

2载体（pGEX4T-1酶切回收产物）

310×ligation缓冲液

4T4DNA连接酶

5ddH2O

7.2操作步骤

取一个200µL的EP管依次加入下列试剂：

2×buffer：

5µL

pGEX4T-1酶切回收产物：

1µL

Pfu扩增并酶切回收的片段：

3µL

T4连接酶：

1µL

离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。

8感受态细胞的制备及转化

8.1实验材料

　　大肠杆菌Top10或BL21（DE3）PlysS

8.2试剂

　①LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2）

　②氨苄青霉素

8.3操作步骤

8.3.1感受态的制备

1从LB平板上挑取单克隆于5mlLB培养基中，37℃200rpm摇菌12～16h。

2将活化过的菌按1～5％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4。

3取1.5ml摇好的菌液于一个1.5ml的EP管中，4℃4000rpm离心3min，弃上清。

4加250µL0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃6000rpm离心1min弃上清。

5加200µL0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。

置于4℃存放。

12h内使用效果最佳。

注意：

无菌操作和保持低温。

培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

8.3.2转化

1将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10µL连接产物（若加质粒，则只需加1µL），温和混匀，冰浴20~30min。

242℃热激90S。

冰浴5~10min。

3加入800µLLB液体培养基，37℃培养45～60min。

4000rpm离心2min，弃去800µL上清液，剩余混匀用来涂板。

4取含有50～100g/mlAmp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4µL200mg/ml的IPTG和40µL20mm/ml的X-Gal），涂板。

537℃倒置培养16~20h。

9克隆的筛选和快速鉴定

9.1试剂

1TaqDNA聚合酶

210×buffer（含MgCl2）

3dNTP

4Loadingbuffer

9.2操作步骤

9.2.1提取质粒测定

　　取一培养皿在底部标记，待转化的细菌菌落长直径到2mm时，用接种针（或用灭菌的牙签、小枪头）挑取单克隆菌落，划在培养皿上作好标记的方格内；同时在对应编号的培养管中接种，培养管中含5mlLB液体培养基。

　　培养皿37℃培养6h后4℃保存。

培养管37℃振荡培养12h左右。

用培养管中的菌液提取质粒。

酶切电泳检查质粒或进行质粒PCR鉴定。

9.2.2菌落PCR鉴定法

直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入20的PCR反应体系中。

试剂

体积（20µL）

2×PCRMix

10µL

引物GAPDH1-1

1µL

引物GAPDH1-2

1µL

模板（单菌落）

1个

ddH2O

8µL

PCR程序：

94℃3min

94℃30s

58℃30s30cycles

72℃45s

72℃10min

电泳检测PCR产物，挑选对应的阳性克隆菌落。

10目的基因诱导表达

1分别挑取对照菌和重组菌菌落，接入5ml含Amp（100g/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。

2分别取500µL过夜培养物接入5ml含Amp（100g/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h左右，至对数中期（OD600=0.5~0.6）。

3向诱导管中加入IPTG使其浓度达到0.6mmol/L，25℃振荡培养过夜，收菌取样进行蛋白电泳检测。

11WesternBlotting

11.2试剂

11.2.1细菌培养和诱导表达

1LB液体培养基

2IPTG

3Amp

11.2.2电泳试剂

130%丙烯酰胺溶液：

丙烯酰胺29.0g，甲叉双丙烯酰胺1.0g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。

21.5mol/LTris-HCl分离胶缓冲液pH8.8（4×）：

取18.15gTris，用1mol/LHCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。

30.5mol/LTris-HCl浓缩胶缓冲液，pH6.8（8×）：

取11.96gTris，用1mol/LHCl调至pH6.8，加水至100ml，4℃保存。

4电极缓冲液（pH8.3）：

取14.49g甘氨酸，3.02gTris，加100ml10%SDS，加水至1升，4℃保存。

510%SDS：

取10gSDS加水至100ml，完全溶解后室温保存。

610%过硫酸铵溶液（AP）：

临用前现配。

7染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、7%乙酸）：

考马斯亮蓝R-2502.5g、甲醇（可用无水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸，溶解后补足水至总体积1000ml。

8脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：

甲醇（可用无水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml，补足水至1000ml。

9样品缓冲液（2×）：

H2O2.4ml，浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml，beta-巯基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰0.2ml。

10TEMED（四甲基乙二胺）

11.2.3转移和杂交试剂

1转移缓冲液：

3.03gTris、14.4g的Glycine、200ml甲醇、定容到1L。

2TBS：

0.1M的Tris、0.9%的NaCl、pH7.5

3TTBS：

TBS中含0.1%的Tween-20

4预染的蛋白marker

5硝酸纤维素膜

6脱脂奶粉

7anti-GST单克隆抗体

8goat-anti-mouse-IgG-HRP（HRP，horseradishperoxidase，辣根过氧化物酶）

93,3'diaminobenzidine（DAB，二氨基联苯胺）

10DAB增强剂

11.3电泳

1准备步骤

将凝胶板水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。

梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在灌胶架上。

按下表配制适合浓度的分离胶，摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，小心在胶上覆盖一层25%的乙醇。

H2O

4.10

29%Acr+1%Bis

3.34

4×分离胶缓冲液（pH8.8）

2.50

10%SDS

0.05

TEMED

0.02

10%过硫酸铵

0.02

总体积

10ml

在分离胶聚合的过程（约30min）中，按下表配制5%的浓缩胶，注意TEMED应在灌胶前才加入。

H2O

3.675（ml）

29%Acr+1%Bis

0.65

8×浓缩胶缓冲液（pH6.8）

0.625

10%SDS

0.05

TEMED

0.05

10%过硫酸铵

0.05

总体积

5ml

分离胶聚合完全后，倒去乙醇，用滤纸吸干胶面上的残余水。

灌注浓缩胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。

浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。

将胶板固定于电泳槽上，上下槽各加入电极缓冲液。

2上样

1）将实验10获得的细胞裂解液按1：

1比例加入2×SDS上样缓冲液混合，100℃沸水浴10min。

10000rpm离心1min，置冰上用上清液来点样电泳。

2）用微量进样器加样，每个点样孔中加入20µL样品，同时点蛋白marker。

每次应洗涤加样器，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。

3电泳

装好冷凝水系统，打开电源，电压为100V，电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。

4染色

从电泳装置上卸下胶板，小心撬开玻璃板取出凝胶，将胶板放入考马斯亮蓝R250染色液中染色2h以上。

5脱色

移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。

根据电泳结果分析诱导菌株有无表达目的基因。

11.4杂交

1将电泳后的胶板取出，裁取和胶等大的硝酸纤维素膜，按照：

海绵-滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序装入电转印槽中，注意硝酸纤维素膜一定要朝向正极一侧。

2加入转膜缓冲液，放在冰水浴中60V电压（150mA）转印2h。

（整个过程应带手套操作）

3取出硝酸纤维素膜用TBS冲洗一次。

室温下，在脱色摇床上用含10%脱脂奶粉的TBS封闭硝酸纤维素膜1h。

倒掉封闭液，用TTBS（含0.1%的吐温-20）洗膜10min。

4取1µLanti-GST单克隆抗体（一抗），稀释在500µL含少量脱脂奶粉（2%的奶粉）的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，将稀释的一抗均匀点在一干净的塑料膜（长和宽大约分别是膜的2.5倍和1.5倍）上，要求点一抗的面积同硝酸纤维素膜等大。

小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在一抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。

25℃放置2h（或4℃过夜）。

5用TBS洗膜2次，用TTBS（含吐温-20，0.05%）洗1次，每次需持续约10min。

6取1µLgoat-anti-mouse-IgG-HRP（二抗），稀释在500µL含2%的奶粉的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，同样，将稀释的二抗均匀点在一干净的塑料膜上。

小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在二抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。

25℃放置1h。

7TTBS（含吐温-20，0.05%）洗膜4~5次，每次5min，将硝酸纤维素膜装入杂交袋中。

8在EP管中按1mlBAD增强剂兑50µLDAB配制显色液，配好的显色液避光保存，30min内有效。

9在杂交袋中加入显色液，室温下显色2～30min，当有清晰的棕褐色条带出现时，用水冲洗硝酸纤维素膜终止反应，观察并分析结果，干燥保存。

（二）实验结果：

（1）小麦总RNA提取及电泳分析

图1-1小麦总RNA

（2）pGEX4T-1质粒的提取的电泳检测

图1-2pGEX4T-1质粒

（3）RT-PCR的cDNA的电泳检测

图1-3RT-PCRcDNA的检测

（4）目的片段的酶切检测

图1-4目的片段

（5）重组质粒的电泳分析

图1-5重组质粒

（6）重组质粒的电泳检测（克隆筛选及快速检测）

图1-6重组质粒的检测

（7）菌落PCR的检测

图1-7菌落PCR

（8）考马斯亮蓝染色

图1-8考马斯亮蓝染色

（9）Western杂交

图1-9Western杂交

（三）实验结果分析：

1）如图1-1，最下端电泳条带为5sRNA，中间为18SRNA，最上边为28SRNA。

其中泳道的大黑块为过量的loadingbuffer。

电泳结果出现弥散的现象是RNA被降解引起的，我觉得跟也可能是提的RNA不纯或是酶的星活性引起的。

2）如图1-2，质粒提取结果条带都比较清晰，总的来说质粒的提取较为成功。

未出现明显条带的组可能是上样不成功所致或是质粒本身问题引起的。

3）如图1-3，条带明显，反转录PCR实验比较成功。

4）如图1-4，由于电泳槽一侧被垫高，使图中每个孔道都出现了一条竖短线，Marker也斜了。

除此之外，Marker和各组的实验条带比较明显清晰。

5）如图1-5，由于各组上样量不同，电泳条带不齐。

条带不均匀，应该是制胶的问题。

6）如图1-6，显示的是重组质粒的电泳检测，实验结果不太理想，虽然各组都出现了条带，但是很多组都不明显，可能是重组质粒的质量不高引起的，左边那块胶，连着的3个组做的都很好，2块胶的Marker都能看见。

7）如图1-7，图中所显示的是菌落PCR的检测，第一块胶除了部分组之外，大部分都能看见明显的条带；第二块胶，多组都出现了弥散的现象，可能是电泳过程中由于电压不稳导致的。

8）如图1-8，考马斯亮蓝对目的蛋白的检测。

9）如图1-9，Western杂交也是对目的蛋白的检测，Market能看清楚，棕色的条带即为目的蛋白所在位置。

（四）实验总结：

本次实验系统地为我们介绍了基因工程技术的基本思路、方法与技能，培训了我们实验设计的能力和操作能力，使我们对基因工程这门课程有了更直观的理解，同时也解决了一些我们在实验中常见问题，提高了我们的实验操作水平，为以后的学习、研究打下一定基础。

对于实验报告的书写方面，对我来说一直是一个挑战，算是又锻炼一次吧。

我觉得在这次实验中自己并没有很积极，以要复习为由，以为懂理论知道实验流程就好了，然而，事实上是什么都没做好，还浪费了自己动手的机会。

老师很和蔼、很耐心，也很会为我们着想，更重要的是能够解决各种问题，真的特别感谢您。

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