实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证.docx

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实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证

题目：

目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证。

一．实验目的:

1.学习目的基因连接转化载体的原理和方法。

2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。

3.学习菌落PCR鉴定阳性克隆的方法和步骤

二．实验原理

1.DNA的连接重组：

具有相同粘性末端的两段DNA分子在DNA连接酶的作用下可以连接在一起。

因为相同的粘性末端同一通过碱基互补配对形成一个相对稳定的结构。

连接温度的选择，理论上的最适温度是连接酶的最适温度---37摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对结构稳定，所以在室温下（12~16度）既可最大限度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。

2.感受态细胞的制备：

将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

3.质粒的导入

在冰上融化感受态细胞，经过42度短暂热激后，由于细胞膜处于液晶态产生裂缝，外源DNA黏附于细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。

然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以促进细胞的愈合恢复。

4.阳性转化的培养基筛选方法。

普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳性，故需要进行PCR鉴定。

5.菌落PCR的原理

通过目的基因的引物进行菌落PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过PCR获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。

从而将阳性与伪阳性菌落区分开。

三．实验材料及设备

1.实验材料：

（1）已完成酶切的载体与目的基因片段。

DNA连接酶，缓冲液等。

（2）冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。

2.实验仪器：

（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；

（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

（3）PCR仪

3.实验试剂：

（1）质粒的转化与转化导入

a.DNA连接酶

b.10Xbuffer;

c.卡那霉素；

d.酶切后的pET28a、目的基因片段等。

e.LB培养液:

胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5;

（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测

a.Goldview（DNA染料）

b.1×TAE缓冲液

c.上样缓冲液（6×buffer）

（3）PCR

a.loadingbuffer

b.四种脱氧核糖核苷酸原料、Taq酶、上下游引物

c.ddH2O

四．实验方法及步骤

实验流程图

载体质粒与目的基因连接转化

1.质粒的连接转化

a）在EP管中分别配置下列的体系：

0.2mlEP管

10×buffer

2.5μL

酶切后的pET-28a

7.5μL

酶切后的目的基因片段

13μL

T4DNA连接酶（考虑连接效率）

2μL

X：

Y=1:

10～30，总体积25μL。

b）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应30min，-20℃下保存备用。

2.转化质粒的导入

a）取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每100μL解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。

b）42℃热冲击45秒，立即置于冰浴5min。

c）热激法：

使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA想粘附并在细胞表面形成脱氧核糖酸酶的羟基-磷酸钙复合物。

此时，将该体系转移到420C下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈运动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收；

d）冰浴过程中不要摇动EP管；（使破裂的菌体自然恢复）

e）再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。

目的：

使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；

f）涂布于含有kana的LB固定培养基表面，37℃培养过夜。

3.PCR鉴定假阳性

反应物

体积（μL）

ddH2O

18.5

10×Buffer

2.5

MgCl2

1.5

4×dNTP

1

引物1

0.5

引物2

0.5

Taq酶

0.5

菌落

挑1个

1.在0.2mLEP管内配制25μLPCR反应体系1个：

实验室没有MgCl2，但是Buffer中含有Mg2+,所以实际添加18.5+1.5=20μL的ddH2O;

PCR单管加样时，对于非常微量的样品一定将样品加于管壁上或者液体中，防止漏样；

加样的顺序：

先加ddH2O，其次是缓冲液和菌落，最后加酶，且要把样品加到液面下，酶从-200C冰箱中拿出后放在冰中待用，加酶时枪尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓慢吹吸几次，保证足够的酶量；

2、用灭菌枪头挑单菌落（在培养皿背面做好标记）接触EP管内，混匀瞬时离心,每组可做5个体系。

由于反应体系体积太小，引起的误差较大，可以一次配置多个（比所需反应体系个数多一个）反应体系，然后分开；

3、放入PCR仪中，设置反应程序：

①94℃预变性5min；

②94℃变性30S；

使双链的DNA模板解旋为单链；

③55℃退火30S；

引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

④72℃延伸60S；

Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5′→3′方向，复制模板的互补链；

⑤重复步骤②~④30次；

（1）新合成的DNA分子可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。

（2）一般进行30个循环，因为此时目的分子的扩增进入平台期；

⑥72℃延伸10min；最后4℃保藏。

4.跑胶验证：

胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将PCR产物5μL与1μL上样缓冲液（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。

将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

五．实验结果

菌落生长情况：

可以看到，左侧的工程菌形成较多菌落，而右侧几乎没有生长，两组工程菌的差异主要在于热激时长（受错误实验操作步骤影响，右侧实验组2只热激了20s，而左侧为正常的45s）

菌落较小，且分布密集，说明菌液浓度过高或者没有摇匀。

图1平板工程菌生长情况（左实验组1右实验组2）

Marker:

DL2000

PCR实验结果

C带750bp

图2菌落PCR凝胶电泳紫外荧光检测结果

说明：

泳道编号依次为：

1红色荧光蛋白工程菌2绿色荧光蛋白工程菌

3绿色荧光蛋白工程菌（老师提供），4DL2000Maker

所得条带较为清晰，部分呈现“U型”，可能是电压过高，胶板温度过高。

泳道123都产生了长度约800bp的条带，与预期结果较为接近，且GFP组的分子量大于RFP组，与事实一致。

证明所验证的三个菌落均为阳性菌落。

老师所提供GFP工程菌由于菌体较多，可见大肠杆菌基因组条带（3条带1000bp到2000bp之间）。

泳道1的下方还出现了一条约300bp的清晰条带，可能是引物因为巧合而PCR扩增出的杂带。

六．结果讨论与结论：

1.实验结论：

通过DNA连接酶，我们将目的基因片段与载体质粒混合，再通过热激发，我们成功将转化质粒导入DH5α，并用含有Kana霉素的固体LB培养基验证，证明所检测的三个菌落都不是假阳性。

2.讨论一：

PCR一般循环重复25~30次，重复次数过多会怎样？

答：

溶重复次数过多，虽然在一定程度上能够提高产物量，但是由于反应时间过长，有一些非特异产物的扩增和碱基错配数也会相应增加；而且随着酶的扩增能力下降，合成目标片段的能力也会随之下降,也可能引起其他的非特异性扩增；此外还可能会导致PCR反应“平台效应”的出现

3.讨论二：

挑取单菌落的注意事项有哪些？

（1）培养皿底部朝上，在酒精灯火焰20cm内操作；

（2）操作时不要讲话，在无风处操作；

（3）挑斑器具要求无菌；

（4）挑选远离群菌落的单菌落，菌落不要过大；

4.讨论三：

2.TaqDNA聚合酶的特性和菌落PCR的原理。

TaqDNA聚合酶的特性：

TaqDNApol具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，但体外使用的Taq酶无3’→5’外切校正活性。

Taq酶最大的特点是耐热性；另外还具有高的催化合成特性。

菌落PCR的原理：

直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，可以快速鉴定菌落是否为含有目的基因的阳性菌落，此pcr的方法通常被用来进行筛选插入的目的基因或者DNA测序分析。

最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的片断大小。

5.讨论四：

BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征，用处。

（1）DH5a和BL21都可以作为表达宿主。

（2）BL21是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。

BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。

（3）DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿主株。

DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNAPOLYMERASE识别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。

而带有T7启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7启动子的T7RNAPOLYMERASE在DH5a中没有。

对于BL21，已将T7RNAPOLYMERASE的编码基因整合到了菌的基因组上，能识别T7启动子，从而可容纳外源基因在此T7启动子的带动下表达。