2株新城疫病毒的分离与鉴定.docx
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2株新城疫病毒的分离与鉴定
2株新城疫病毒的分离与鉴定
【摘要】盐都、建湖两养殖户鸡群大批死亡，有呼吸道症状，拉稀。
剖检喉、气管内有大量黏液，盲肠扁桃体出血，腺胃乳头出血，脂肪肝，脾脏肿大，卵子明显变性，胰脏出血，疑似新城疫病例。
采集病鸡的肝，肠道等病变组织。
经处理后接种10日龄非免疫鸡胚，致死鸡胚。
取鸡胚尿囊液，做HA试验，两样品均有血凝性，再用抗H5亚型禽流感病毒阳性血清、抗H9亚型禽流感病毒阳性血清和抗新城疫病毒阳性血清进行HI试验，结果显示仅抗新城疫病毒阳性血清对两样品有血凝抑制作用，说明分离到的病毒均为新城疫病毒。
通过MDT实验发现两地鸡群感染的新城疫病毒均为强毒株。
【关键词】鸡；新城疫病毒；分离；鉴定；血凝试验；血凝抑制试验
综述
新城疫（ND），也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病，常呈败血症经过，主要特征是呼吸困难，下痢，神经症状，黏膜和浆膜出血，腺胃黏膜出血具有诊断意义[1]。
感染鸡的呼吸道、循环系统、胃肠道紊乱及神经症状都很明显，蛋鸡可有突发性产蛋下降、产薄壳蛋或鸡蛋白蛋。
临床表现取决于宿主的年龄及其免疫状态、感染毒株的毒力及嗜性；一般潜伏期为5天[2]。
世界范围内曾经发生过4次大规模的流行。
首次大爆发源于东南亚和英国，从1926年到1960年，经过30多年的时间，从印泥和英国传遍了全世界。
第二次大流行始于20世纪60年代，从中东迅速传播到世界大部分国家，此次流行传播速度较快，原因是养禽业已经拓展为国际贸易，空中运输禽类及珍禽类是此次流行的重要传媒。
第三次流行始于1974年前后，疫源地尚无定论，但由于疫苗的推广使用，使得引起疫病流行的病毒更加复杂[3]。
第四次流行始于20世纪70年代晚期，源于中东，传染源是鸽副黏病毒I型，1981年传至欧洲，然后迅速传遍世界，并流传至今[4]。
特别是20世纪90年代后，该病在欧洲、亚洲许多国家发生，对养禽业造成了巨大的损失。
特别值得关注的是鹅的NDV感染，在1997年以前，几乎没有鹅感染NDV发病的报导，即使人工攻毒，水禽的发病率和致死率也较低。
但自1997年以后，NDV对鹅的感染率、发病率及病死率明显升高，造成了严重的经济损失。
对于鹅NDV来源，究竟是在鹅体内长期试用的结果，还是鸡源NDV的演化，目前没有定论，但从水禽上分离的NDV毒力变化已引起人们的关注。
国外学者Rosenberger和Sbortridge分别在加拿大、香港分离出了鹅副黏病毒，国内学者王永坤1997年在江苏的扬州也分离到鹅副黏病毒[5]。
这种最近才发生的新病，对小鹅的发病率和死亡率几乎100%，对成年鹅的发病率也达到50%～70%，死亡率达到10%～50%。
1、病原及流行病学
新城疫病毒属于副黏病毒科腮腺炎病毒属，完整病毒粒子近圆形，直径为120～130nm，有不同长度的细丝。
有囊膜，在囊膜的外层呈放射状排列的突起物或称纤突，具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成分，病毒核酸类型为单股、负链、不分阶段的RNA。
新城疫是目前我国最常见、最普遍、危害最严重的禽类传染病，归纳本病的流行趋势有以下特点：
1）主要发生于小规模、大群体、密集型的农户散养鸡群，通常鸡舍简陋、环境条件差，由于防疫意识不强、饲养管理不善、垫料替换不勤，在冬、春阴雨寒冷季节或夏季高温天气，易造成大面积流行。
2）从发病日龄来看，各种日龄的家禽都可发病，临床病例以在15～40日龄、60～120日龄、170～330日龄等三个阶段较为多见。
3）经过多次免疫接种、抗体水平较高的鸡群仍可发病，且发病率和死亡率与发病日期、新城疫毒力的强弱、饲养管理的优劣、有无并发症以及诊疗是否及时有关。
4）本病主要通过呼吸道和消化道感染发病，健康鸡通过接触病死鸡的排泄物、分泌物、病死鸡污染的饲料、饮水、垫料、空气等传播，病死鸡是本病的主要传染源（目前国内大部分养鸡场对病死鸡不作科学处理是造成疾病不断发生的重要因素）。
5）目前虽然我国各地所有鸡群对新城疫采取了强化的免疫预防措施，但新城疫仍然以不同的形式在流行，因此可以说，几乎很难说有哪一个鸡群真正消灭了新城疫病毒的感染，然而，在不同类型的鸡群，NDV感染发生和流行的特点各不相同。
在临床上，一般都是以非典型新城疫流行的，在成年鸡群中多表现为一时性产蛋下降（特别是产蛋高峰期）[6]。
2、诊断
由于急性、典型新城疫的症状和病变与高致病性禽流感十分相似，因此，仅凭症状与病变很难作出准确的判断。
可参考鸡群的免疫程序和血凝抑制抗体滴度作出判断，如已有明显的新城疫临床症状和病理变化。
至于非典型新城疫，由于其呼吸道症状与传染性支气管炎、传染性喉气管炎、支原体感染和非高致病性禽流感相似，而减蛋综合征、禽流感等多种疾病均可引起产蛋下降，所以凭临床症状和病理变化很难作出非典型性新城疫的初步诊断，必须进行病毒分离鉴定和其他的实验室诊断才能确诊。
1）病毒分离与初步鉴定：
病料接种9～11日龄的非免疫鸡胚，37℃恒温箱培养，观察鸡胚的死亡情况。
2）病毒的进一步鉴定：
因禽流感病毒、减蛋综合征等其他一些病毒也具有凝集鸡红细胞的活性，所以在HA呈阳性后，还必须用新城疫抗血清对分离的病毒进行红细胞凝集抑制试验（HI试验），最好同时分别用新城疫、禽流感和减蛋综合征的抗血清与分离物做HI试验。
如果新城疫抗血清能抑制被分离物的HA活性，而其他血清不能将其抑制，则被分离的病毒为新城疫病毒；如病毒的HA活性分别能被新城疫及禽流感的抗血清所抑制，则提示分离物中在感染了新城疫的同时还合并感染了禽流感。
在确定为新城疫病毒后，还必须进行病毒的毒力测定，以确定被分离的病毒是野外强毒还是疫苗株病毒。
作为一般生产性诊断，可将分离的病毒接种非免疫鸡或SPF鸡，如果病毒能致死敏感鸡，则可确诊。
必要时也可进一步作致病指数的测定，包括鸡胚平均死亡时间（MDT）、脑内接种指数（ICPI）、静脉接种指数（IVPI）、已凝集的红细胞洗脱速度、蚀斑形成特点、病毒基因序列分析等[7]。
3）其他诊断方法：
主要包括免疫荧光抗体、酶联免疫吸附试验（ELISA）、单克隆抗体技术、核酸探针等分子生物学技术等。
由于目前鸡群已普遍接种新城疫疫苗，血清学方法如未能区分抗体来自疫苗还是野外病毒之前，必须比较感染前后的抗体滴度是否有明显上升，才具有诊断意义。
4）与禽流感的鉴别诊断：
H5亚型高致病性禽流感很少感染30日龄以内的雏鸡，其发病急、潜伏期和病程短，头肿、腿鳞出血，短时间内大批死亡，但无肠道枣核样坏死。
发生H9亚型低致病性禽流感时，有头肿、拉稀和呼吸道症状，但病程较ND长，死亡也没有ND集中，也无神经症状和枣核样坏死，且死亡鸡通常有卵黄性腹膜炎和输卵管内分泌物。
3、综合防治
新城疫常以散发存在，对养殖业危害很大，必须严格按国家有关法令和规定，对疫情进行严格处理，必须认真地执行预防传染病的总体卫生防疫措施，以便减少爆发的危险，尤其是在每年的冬季，养鸡场均应采取严格的防范措施。
1）把好疫苗质量关：
选择正规厂家生产的疫苗，严格遵守疫苗的运输、贮存规定，按照疫苗使用说明书进行操作。
2）排除母源抗体的干扰：
有条件的用户（场）可监测其母源抗体水平，根据母源抗体水平的高低，利用“最佳首免日龄=（1日龄测得母源抗体滴度-4）×4.5+5，如果无法测得母源抗体时，可在1日龄用新城疫油乳剂灭火苗注射，同时IV系苗点眼或滴鼻，即可排除母源抗体的干扰，及早产生较强的免疫力。
3）合理制定和调整免疫程序：
根据当地疫情，按先主后次的原则，合理制定免疫程序，尤其感染了法氏囊病后，应在鸡群恢复后对ND进行补免。
4）选择最佳的免疫途径：
对个体免疫时，皮下注射或肌肉注射效果最好，点眼次之，滴鼻再次。
对群体免疫而言，气雾免疫好于饮水免疫。
5）加强饲养管理，饲喂优质全价的饲料，使其内脏器官及免疫系统能正常发育。
同时给鸡群创造安定、舒适的环境，使免疫鸡群处在健康状态。
6）切忌滥用药物：
在免疫期间，禁止使用氯霉素、磺胺、呋喃、激素类药物，在免疫前后三天内更不可带鸡消毒，当然也并非任何药物都不能用，可适当用青霉素、喹诺酮等药物，以防继发感染。
7）如鸡群发病，要尽早隔离、并销毁病死鸡，同时对鸡群进行紧急接种。
随着养殖规模的不断扩大，强毒污染时有发生，而疫苗接种只能减少病毒侵入鸡群时带来的损失，不能消灭鸡群内存在的强毒。
因此，一定要加强饲养管理和卫生防疫措施，严格消毒，切断每个可能传播的途径，尽可能给鸡群一个清洁、舒适的环境，以利于其生长[8，9]。
4、材料与方法
4.1试验材料
4.1.1病料来源
病例一：
2013年3月2日，盐都某养殖场鸡群发病，病死鸡日龄为300d，共养殖1000只，死亡200多只，剖检多呈现腹膜炎症状，喉、气管内有大量黏液，腺胃乳头出血，拉稀，脾脏肿大，卵子变性，2月龄通过饮水的方式用过副黏病毒疫苗，呼吸道、气管都有出血现象，无明显的神经症状，编号为YDND。
病例二：
2013年5月20日，建湖某养殖场的2000只育成鸡，18周龄突然发病，每天死亡30-40只，且死亡有日渐增多的趋势。
部分鸡精神沉郁，羽毛蓬乱，挤在一起或独处，缩于阴暗角落，极度衰弱，食欲减退或废绝，腹泻，排黄绿色粪便，剖检肌胃角质层下有点状或片状出血，腺胃乳头出血，部分肠管出血，编号JHND。
4.1.2实验动物
10日龄非免疫鸡胚（购于山东家禽所SPF鸡场）。
4.1.3制备1%鸡的红细胞
4.1.3.1PBS的制备：
氯化钠8g；磷酸氢二钠3.63g；蒸馏水100ml。
4.1.3.2抗凝剂的制备：
柠檬酸三钠5g，氯化钠0.9g，蒸馏水100ml。
4.1.3.31%鸡红细胞的制备：
采集三只健康公鸡的混合血，抗凝剂与鸡血比为1：
4。
加入PBS洗涤红细胞，每次洗涤在2000r/m离心15min，连续洗涤4～5次，最后红血球压积，1体积红血球加入99体积PBS，混匀，4℃保存备用1～3天。
4.1.4普通琼脂平板
将10g蛋白胨，3ml牛肉膏，5g氯化钠溶解于100ml蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液约2ml调PH到7.2～7.4，加入琼脂2g，加热至使琼脂完全溶解，分装、高压灭菌（121℃，15min），浇平板，待用。
4.1.5阳性血清
NDV阳性抗血清，H9亚型禽流感病毒的阳性抗血清，H5亚型禽流感病毒的阳性抗血清，（均由江苏省流行病学研究中心实验室提供）。
4.2试验方法
4.2.1细菌学检查
为区分是细菌病还是病毒病进行鉴别诊断：
取肝、脾按常规触片染色镜检，同时接种普通琼脂平板，37℃培养48h后观察。
4.2.2病毒分离
以无菌法取病死鸡的肝、脾、泄殖腔、气管等脏器。
将病料按1：
5加入双抗PBS（含庆大霉素与链霉素）于高压过的研钵中研磨，收集研磨液，反复冻融三次。
以7000r/m，离心10min，再次用双抗PBS1：
2稀释，离心同上。
置4℃冰箱，备用。
4.2.3鸡胚接种
1.用照蛋器照蛋，弃去死胚、未受精胚及不健康的鸡胚。
画出气室边缘和无毛细血管处。
2.气室端先用碘酊消毒，然后用75%的酒精脱碘，再用消毒过的镊子在各鸡胚上打一小孔。
3.用消毒的注射器吸取处理好的病毒样品，按每只0.1～0.2ml，接种于鸡胚的尿囊腔，用石蜡熔融封口。
4.置35～37℃恒温箱培养，24h死亡鸡胚弃去，收集24～96h内死亡鸡胚的尿囊液。
5.收胚前将鸡胚转移至4℃冷藏6h。
用75%的酒精消毒鸡胚气室部分，用无菌镊子将消毒过的蛋壳打碎，再用另一把无菌镊子将壳膜和尿囊膜撕开，并将鸡胚轻轻推向一侧，压住，用吸管收取尿囊液。
4.2.4血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）
4.2.4.1HA试验
按常规微量法进行，结果以出现100%凝集的病毒的最大稀释度为该样品的HA效价。
试验操作方法：
将25µlPBS或生理盐水加入96孔V型微量反应板A～H行的1～12孔。
被检病毒病料各25µl分别加入A～H行的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去25µl，12孔为阴性对照。
没空再加入25µlPBS或生理盐水，最后悬空加入25µl的1%鸡红细胞于每一孔。
混匀，室温静置，观察试验结果，确定HA滴度。
4.2.4.2HI试验
按常规微量法进行，结果按完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度为血凝抑制价。
试验操作方法：
将25µlPBS或生理盐水加入96孔V型微量反应板A～H行的1～12孔；在第一行、第二行和第三行的第一孔依次加入NDV、H5亚型禽流感、H9亚型禽流感病毒标准阳性抗血清；用移液器对血清进行倍比稀释至第10孔，然后每排弃去25µl；在每排1～11孔加入25µl4单位病毒，置振荡器上混匀，放入37℃恒温箱中作用10min；在每排各孔加入1%鸡红细胞50µl，第12孔补加50µlPBS保证总体积一致，振荡混匀后，室温或置37℃恒温箱中作用15～30min，观察试验结果。
4.2.5鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定
用灭菌生理盐水连续10倍稀释病毒（10-1….10-9），每一稀释度接种5枚非免疫鸡胚，每胚0.2ml，同时设置5枚接种生理盐水的鸡作为对照组。
37℃恒温孵育，弃取24小时内死亡的鸡胚，之后每隔6小时观察一次，直至120小时。
能够使所有鸡胚致死的病毒的最大稀释倍数即为病毒的最小致死量（MLD），MDT是MLD致死鸡胚的平均死亡时间。
经试验得知这两样品的最小致死量均为10-7稀释度，取该稀释度接种5个10日龄的非免疫鸡胚，每个尿囊腔接种0.2ml。
同时设置5枚接种生理盐水的鸡作为对照组，接种后的鸡胚在37℃孵育7天，每天早晚各照胚一次，记录每组鸡胚中各个胚死亡的时间。
5、结果
5.1细菌学检查
37℃培养48h后，观察平板，琼脂平板上无任何细菌生长，表明该样品的病原不是细菌。
5.2病毒分离
将处理的病料接种10日龄非免疫鸡胚后，于24h～96h内死亡，鸡胚呈全身出血性病变，尤其是头部和四肢出血严重。
取死亡的鸡胚置4℃过夜（不超过24h）后无菌采集尿囊液，尿囊液清亮。
5.3HA和HI试验结果
通过HA试验，可知两样品的血凝价分别为7log2、6log2（见表1）；通过血凝抑制试验可知：
这两病毒样品都既不能被H5亚型禽流感抗血清抑制，也不能被H9亚型禽流感抗血清抑制，只能被NDV阳性抗血清抑制，其HI效价分别为1：
4log2、1：
3log2（见表2），结果显示从两地病鸡中分离出的病原都为新城疫病毒。
表1HA试验结果
样品号123456789101112
YDND#######—————
JHND######++++++———
注：
#为完全凝集；++为不完全凝集；—为不凝集
表2HI试验结果
样品阳性血清123456789101112
YDNDNDV抗血清————#######—
YDNDH5亚型禽流感抗血清###########—
YDNDH9亚型禽流感抗血清###########—
JHNDNDV抗血清———########—
JHNDH5亚型禽流感抗血清###########—
JHNDH9亚型禽流感抗血清###########—
注：
#为完全凝集；++为不完全凝集；—为不凝集
5.4MDT的测定
通过该试验可知，鸡胚平均死亡时间（MDT）分别为47.6h、44.4h（见表3），表明这两个样品中分离出来的NDV的毒力均为强毒。
表3MDT实验结果
毒株最小致死量鸡胚死亡时间（h）MDT（h）
12345
YDND10-7/0.2ml444250534747.6
JHND10-7/0.2ml424738455044.4
6、小结与讨论
盐都、建湖两养殖户的鸡群大批死亡，根据临床症状和病理变化，初步怀疑为新城疫病毒感染，采集病料进行血凝试验和血凝抑制试验，结果显示两地鸡群感染的病原均为新城疫病毒，接着通过MDT试验表明这两个样品中分离出来的NDV的毒力均为强毒。
仔细分析病例，我们不难得出：
尽管病例一的鸡群在二月龄已注射过鸡副黏病毒疫苗和禽流感疫苗，但仍发生的了新城疫，而且发病率及病死率都较高，其原因可能有：
1）首免时间不准确：
如果首免时间过早，则疫苗被中和；而过晚则母源抗体降低，不能保护雏鸡；
2）机体免疫功能下降：
传染性法氏囊病、马立克氏病等的病毒和球虫、组织滴虫等感染都能侵害免疫系统而造成免疫抑制，导致肌体免疫功能降低，对疫苗的应答能力减弱，对疾病易感性增加；
3）缺乏综合防治观念：
部分养鸡户认为接种疫苗就有了保证，而忽略了平时的饲养管理、必需的营养添加和经常的消毒卫生。
4）疫苗保存不当引起失效：
养鸡户对疫苗运输、保管和使用不当，如取回疫苗后无冰箱设备、长期放在高温或直射阳光下或稀释后长时间未用等，造成疫苗失效而使免疫失败。
另外新城疫毒力的变异，野毒的侵袭，各种应激因素等其他方面也可以造成新城疫的流行。
从结果上看，YDND、JHND的MDT值分别为47.6h、44.4h，即表明分离到的毒株符合强毒株的特征。
新城疫病毒只有一个血清型，其抗原性一致，但毒力差异很大，一般认为强毒株MDT为40～60小时，ICPI≥1.6。
但近年来，发生更多的则是关于非典型新城疫的报导：
它主要发生在免疫鸡群中，临床症状及剖检变化都因不表现典型新城疫的特征而往往被忽视，发病时间多在30日龄以后，一般以呼吸道和消化道症状为主，病鸡主要表现为呼吸困难、咳嗽和气喘，采食、饮水无明显变化或逐渐减少，嗉囊少食或空虚，初期排黄绿色稀粪，后期排黄色粪便，用药物治疗效果不明显。
在采集病例及基层实际工作中，我们发现并不是所有的养殖户对新城疫病毒都有清晰的理解，在不同方面还存在不少误区，主要表现在：
1）鸡群中出现绿色粪便就认为是新城疫：
鸡群感染新城疫后会出现腹泻，拉黄绿色或黄白色稀粪等，但禽流感、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、禽霍乱、大肠杆菌病等都会出现黄白色或黄绿色粪便。
2）鸡群中出现有神经症状的鸡就认为是新城疫：
鸡在患慢性新城疫后会出现扭头、头向后仰、腿翅麻痹、运动失调、抽搐、两脚向后伸等神经症状。
但其他的许多疾病也可出现神经症状，如神经型马立克氏病、禽脑脊髓炎、维生素缺乏等。
3）疫苗免疫的越早越好：
雏鸡出壳后体内有来自种蛋的母源抗体，这种母源抗体可保护雏鸡约1～2周，因此，没有抗体检测条件的养鸡户，可在一周龄进行首免比较合适，有条件的最好是检测一下母源抗体，然后再确定首免时间。
4）疫苗免疫的剂量越大越好：
根据鸡群的情况、疫苗的种类及免疫方法，适当加大疫苗的剂量是可以增强免疫效果的，但用量过大就会造成鸡群强烈的应激，反而会使免疫应答能力减弱而影响免疫效果，特别是活疫苗，用量过大还会造成严重的疫苗接种反应。
5）免疫的次数越多越好：
任何一种疫苗都有一定的免疫期，如果在疫苗的有效免疫期内，免疫抗体水平较高的时候再进行免疫，疫苗就会与原有的抗体发生中和反应，使两次的免疫都起不到应有的效果，过于频繁的免疫会使机体的免疫应答能力降低而出现免疫麻痹。
最好的方法是对免疫抗体水平进行定期检测，根据抗体水平的高低确定免疫次数和时间。
致谢
本人衷心感谢包汇慧老师的悉心指导。
本论文从选题、课题设计、实施到论文写作无不凝结着指导老师的一片心血，感谢王涛、刘金彪等老师在试验和论文写作的过程中的帮助。
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