分子生物学实验指南11学生打印.docx

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分子生物学实验指南11学生打印

分子生物学

实

验

指

南

西南大学生命科学学院

2014年11月

所有版权归杨春贤所有

目录

实验一、DNA的提取及检测..…………………..…………...…………..3

实验二、PCR扩增目的基因及检测………………………………………6

实验三、目的基因片段的回收、连接………………………………….....8

实验四、大肠杆菌DH5感受态细胞的制备………………….…………10

实验五、连接产物的转化、筛选及PCR检测………………………….....13

实验六、质粒DNA的抽提、酶切（生工专业选作）…………………........15

实验七、RNA的抽提与检测（生科专业选作）………………………......18

实验一DNA的提取及检测

一、实验目的与原理简介：

抽提的DNA可用于PCR、Southernblotting、DNA文库构建等操作。

细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，细胞质中含有少量的DNA。

细胞内的各种DNA总称为总DNA。

核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。

高等植物的核DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。

在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。

植物DNA的提取常用的有以下两种方法：

SDS（十二烷基硫酸钠）法：

高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNaseA消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。

该法操作简便，能满足大多数实验需要。

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：

CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐浓度（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，通过离心就可将复合物同变性的蛋白质、多酚、多糖杂质（沉淀项）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质，直接向水相中加入预冷的异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，分离DNA沉淀并经75％乙醇漂洗后溶于TE（或纯水）得到DNA的粗提物。

用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。

用RNase水解RNA，用酚：

氯仿：

异戊醇和氯仿：

异戊醇抽提去蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。

二、实验准备：

CTAB抽提液：

2%（w/v）CTAB

100mmol/LTris-HCl（pH8.0）

20mmol/LEDTA（pH8.0）

1.4mol/LNaCl

注：

抽提含多酚较多的植物材料时，上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）；

抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。

临用之前向装有上述抽提液的试管中加入约2%-3%（v/v）的β-巯基乙醇。

醋酸钠：

3mol/LNaAc

用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。

TE溶液：

100mmol/LTris-HCl

1.00mmol/LEDTA

调pH值至8.0。

为防止Dnase的降解作用，提取使用的各种器具及溶液均应经过高压灭菌。

三、操作步骤（CTAB法）:

DNA的粗提

1、向10ml离心管中预先加入4mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇，65℃预热；

注：

巯基乙醇可以打断多酚氧化酶的二硫键，保护酚类物质不被氧化，从而保护核酸不被降解。

EDTA可以螯合二价离子，而后者是DNA酶的活性所必需的，从而抑制DNA酶的活性。

2、取约1g的植物材料用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入该10ml离心管中，迅速混匀；

3、于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）颠倒混匀三次；

4、冷至室温后加入等体积（4ml）氯仿：

异戊醇（24：

1），轻柔颠倒混匀使乳化10min；

5、10000转／分离心10min（18-20℃）；

6、吸取上清（约4至5ml）于另一干净的10ml离心管中；　　　　　　　　　　　　　　　

注：

根据需要可用氯仿：

异戊醇如上法重复抽提一次；吸取上清时一定不要打破沉淀层

7、吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；

注：

若没有沉淀出现，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3MNaAc，混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min；

8、用玻璃钩子挑出DNA（或用被剪去尖端的1.5mlTip头吸住DNA沉淀团），放入盛有1ml75%乙醇的1.5mlEppendorf管中；

注：

若无法直接挑取时用离心法沉淀DNA

9、用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；

10、用1ml75%乙醇再漂洗一次；

11、用无水乙醇再漂洗一次；

12、沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；注：

不要过度干燥

13、用500μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物，可用于PCR等。

DNA的纯化

1、向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μlRNaseA（约40-100μg）；

2、于37℃酶解RNA1hr或65℃酶解RNA30min以上；

3、10000g常温离心10min，吸取上清；

4、加入500μl酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1），轻轻颠倒混匀10min；

5、10000g以上常温离心10min，吸取上清；

6、加入500μl氯仿：

异戊醇（24：

1）轻轻颠倒10min；

7、10000g以上常温离心10min，吸取上清；

注：

根据需要可重复用氯仿：

异戊醇如上法再抽提1-2次，以充分去除蛋白和酚

8、向上清中加入1/5-1/10体积的pH4.8-5.2的3MNaAc，，加入2.5倍体积无水乙醇，于－20℃沉淀30min以上；

9、12000g、4℃低温离心10min，吸干液体；

10、沉淀用75％乙醇500μl漂洗二次；

11、沉淀于室温或64℃以下恒温箱中干燥片刻至刚开始出现半透明状，勿过度干燥；

12、加入100-200μl重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶；

13、取5μlDNA电泳检查DNA的质量；

14、100-500倍稀释后于分光光度计上测定OD260及OD280，分析DNA的浓度和质量；

15、保存DNA于-20℃

注：

DNA样品的保存应避免引起磷酸二酯键断裂的因素，如重金属、苯酚、醚氧化物及辐射引起的自由基等，还要避免紫外线照射（320nm波长的紫外线会引起DNA交联，260nm紫外线会造成TT二聚体）。

一般可溶于TE或纯水于4度或—20度保存。

四、实验结果分析：

抽提到的植物总DNA在凝胶电泳检测时应呈现涂抹片状（即smear状），这是因为植物总DNA在抽提过程中降解成长短不一的均匀分布的片断所致。

纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，如果大于1.9，表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质或酚污染。

OD260/OD230应大于2.0，如小于2.0，表明溶液中有残存的盐及小分子杂质（如核苷酸、氨基酸、酚等）。

DNA的浓度可以利用自外分光光度法进行测定，对于双链DNA，OD260=1.0时溶液浓度为50μg/ml。

DNA样品浓度（μg/μl）等于OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000。

一般稀释100-1000倍。

五、注意事项：

当植物材料表面或内部含有较多水分时，液氮冷冻会形成冰晶而妨碍研磨，所以在液氮冷冻之前，要用滤纸吸干植物材料表面的水分。

对于含水量大的新鲜植物材料，如某些植物叶片、疏松的愈伤组织，冷冻前要用乙醇擦拭，是指部分脱水。

研磨使用的器皿（包括药匙）要在液氮中预冷，研钵只能使用陶瓷的，而不能用玻璃的。

要保证研磨的全过程均在冷冻状态下进行，不允许材料在加入提取缓冲液之前融化。

为最大限度的避免DNA降解，提取过程中各种操作均应温和的进行，避免剧烈振荡，不可用反复吸打的方法助溶DNA沉淀。

实验二、PCR扩增目的基因及检测

一、实验目的与原理简介

学习PCR法体外扩增DNA的原理及操作方法；了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握引物设计的原则和方法。

聚合酶链式反应（PCR），即通过引物延伸核酸的某一区域而进行的重复双向DNA合成。

PCR的原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。

多次重复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

由于PCR在分子克隆和DNA分析中具有许多广泛的用途，特别是近年来迅速出现了许多以PCR为基础的新技术，因此，学习并尽快掌握这一门常规技术是十分必要的。

影响PCR反应的因素主要在于两个方面：

1）引物的合理设计；2）PCR反应体系及反应条件的优化。

二、仪器及药品

PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪等；

TaqDNA聚合酶，10×PCRbuffer，25mmol/lMgcl2，0.225mmol/ldNTP，10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul）

三、实验步骤

1）在50ul反应体系中分别加入：

MiniQH2O37.5ul

10×PCRbuffer5ul

25mMMgCl23ul

10mMdNTPmix1ul

引物1（10μM）1ul

引物2（10μM）1ul

Taq（2to5units/ul）0.5ul

模板（cDNA）1ul

终体积为50ul

注意：

如果只是普通的检测，而无须回收时，则25ul的反应体系即可（上述体系中的各成分相应减半）

2）短暂离心混匀后，放入PCR仪中，反应程序如下：

I）94℃4min（时间根据模板来确定）

II）94℃45S

60℃45S（退火温度和时间根据引物来确定）

72℃1min（时间根据扩增片段长度来确定）

30-35个循环（循环次数根据扩增目的来确定）

III）72℃7-10min

IV）4℃保存（一般不保存，保存对PCR仪损坏大）

1）反应完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果

四、注意事项

1）实验必须严格操作，杜绝所有可能的DNA痕量污染，并同时设置阴性参照（即同样的反应体系和条件下不加模板而进行PCR，来检测反应体系是否被污染）；

2）PCR反应对于不同的模板及引物而条件不同，具体扩增的反应条件需要通过实验来摸索和优化，从而建立最佳条件；

3）推荐采用热启动策略（即等模板94℃充分解链后，一般94℃保持3min即可，再加入酶以减少非特异扩增现象的发生）来提高反应的特异性；

4）Taq酶永远最后加入反应体系，酶极易失活，应该在冰盒上操作，用完及时放回冰箱中；

5）PCR中尽可能使用高质量的水如MiniQH2O；

6）引物浓度不宜过高（我们一般的使用浓度为10μM），否则易形成引物二聚体，同时还可能会导致非特异性产物的扩增；

7）新合成的引物，回来后稍加离心后，可用MiniQH2O配成高浓度的母液，并取部分配成10μM的工作液。

附：

PCR引物的设计原则

PCR引物的设计是否合理，是决定PCR体外扩增能否成功的关键因素之一。

因此，进行PCR引物的设计时需要注意以下几个方面的问题：

1.引物的长度

引物的长度一般设计在15-30个核苷酸之间比较合适。

引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶的最适反应温度。

同时合成长引物还会使合成费用大大增加，所以没有必要设计过长的引物。

我们实验中通常设计的引物长度在21碱基左右。

2.引物的GC%含量

尽可能的将引物的GC%含量设计在40-60%的范围内，因为GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。

Tm值的估计可简单地根据经验公式Tm=4GC+2AT+3.3℃

而最适退火温度Taopt（optimalannealingtemperature）=Tm-5℃

3.引物的3’端起始碱基

椐研究报导，Taq在3’末端错配时延伸效率是不一样的，此时的延伸效率为T>G=C>A。

也即当引物的3’末端为A是，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物的设计可考虑3’末端为A，用以提高复制的精确性。

不过，也有研究报道认为3’末端应该设计为G或C，这是因为G与C的氢键多于A与T，能更好的与模板结合并开始DNA的合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。

总之，无论那种情况下，引物的3’末端尽量不要考虑使用T。

4.引物无回文对称结构（亦称发夹结构）

引物自身应无回文对称结构，否则会形成茎环结构。

据报道，形成茎环的环在5-7个核苷酸以上时结构非常稳定，茎越长越稳定。

茎环的生成与否还会与引物的Tm值有关，引物的Tm值越高时也越能容忍此类结构，因为在相当高的温度下茎环结构会自行打开。

尽管如此，设计中仍要尽量避免此类结构。

5.引物自身不能配对

5’-TCGA-3’

3’-AGCT-5’

即引物自身之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3’端。

例如，一引物的3’末端碱基为5’-TCGA3’，那么另一同样的引物会与之形

的结构，从而扩增形成引物二聚体。

6．两个引物的Tm值

设计时注意尽可能使两个引物的Tm值相近，不然两个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增的效果。

7．两个引物之间不能配对

如果两个引物之间能配对的话，就会生成引物二聚体，而影响扩增效率。

以上是PCR引物设计的基本原则，设计时特别要注意引物的3’末端与模板DNA的精确配对，否则易造成非特异扩增。

我们只要综合考虑以上原则，应该可以设计出参数比较合理的引物，相信通过一定的实际操作来锻炼一下，引物的设计应该不是一件难事！

三、实验报告

内容必须包含：

引物的序列和算出的Tm值，找到扩增起始位置、结束位置、扩增长度，算出延伸时间，列出PCR反应体系和条件，附1％琼脂糖凝胶电泳检测图，并分析实验成败原因以及今后的注意事项。

实验三、目的基因片段的回收、连接

一、实验目的与原理简介

了解用低熔点胶回收目的基因片断的方法，掌握从凝胶中回收目的片断的原理以及应注意的事项。

无论是酶切获取目的片段也好，还是PCR扩增目的片段也罢，我们常常需要对目的片段进行割胶回收、纯化和亚克隆等操作，从而为后续的DNA重组等分子操作做准备工作。

回收目的片段的方法很多，常用的有冻融法，低熔点琼脂糖法，透析代法、电泳回收法、玻璃孔回收法等。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。

低熔点琼脂糖是在琼脂糖的主链上经羟乙基修饰，其凝固温度降为30℃，融化温度为65℃，这一融化温度低于绝大多数双链DNA的变性温度。

利用这种凝胶高纯度，低熔点的特点，发展了回收DNA片段的方法。

经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段，可用于DNA连接，探针标记以及内切酶消化。

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。

如果要克隆较小的DNA片段（＜10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

　　1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。

也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。

由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。

所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度，以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。

还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。

带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

二、仪器和试剂

移液枪，DNA回收试剂盒，恒温水浴锅，pMD19-TVector等

三、实验操作步骤

1．目的片段的回收纯化

操作步骤：

第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙

醇!

所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1）柱平衡步骤：

向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，

12,000rpm（~13,400×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放

回收集管中。

2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的

离心管中，称取重量。

3）向胶块中加入3倍体积溶胶液PN；当回收的目的片段<150bp或琼脂糖凝胶浓

度>2%时，建议使用6倍体积溶胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为

100μl，依此类推）。

50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，

以确保胶块充分溶解。

如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置

几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。

注意：

胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高

温度时结合DNA的能力较弱。

4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2

分钟，12,000rpm（~13,400×g）离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附

柱CA2放入收集管中。

注意：

吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。

5）向吸附柱CA2中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：

如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2－5分钟再离心。

6）向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（~13,400×g）离心30－60秒，倒掉废液。

7）将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2分钟，尽量除尽漂洗液。

将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

注意：

漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，（如果回收的目的片段>10kb，则洗脱缓冲液EB应置于65–70℃水浴预热），室温放置2分钟。

12,000rpm（~13,400×g）离心2分钟收集DNA溶液。

注意：

DNA也可以用缓冲液（10mMTris-Cl，pH8.0）洗脱。

为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤8。

洗脱体积不应小于30μl，体积过少影响回收效率。

洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。

若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

2.DNA回收片段与pMD-19TVector载体的连接

在200µLEppendorf管中加入下列组分：

pMD-19TVector0.5µl

InsertDNA4.5µl

SolutionI5µl

加dH2O至10µl

轻轻混匀，16℃连接30min以上用于转化DH5α感受态。

三、实验报告

内容必须包含：

附1％琼脂糖凝胶电泳检测图，并分析实验成败原因以及今后的注意事项。

四、注意事项：

1、回收目的基因片断的电泳缓冲液要用新鲜的溶液，胶的浓度视片断大小而定，片断越大胶的浓度越低，反之，越高，对一般的回收而言0.8-1.0%就足够了；

2、影响琼脂糖凝胶的迁移速率DNA分子量大小，分子量越大，所受阻力越大，迁移得越慢；DNA构象也影响迁移率，一般而言，超螺旋>环状>线性.电压越大，迁移率也越大.电泳缓冲液的组成也有影响，离子浓度越大，迁移率也越大，电泳时要用1倍的缓冲液，以避免过热，使凝胶融化（各种胶浓度的分离范围见表1）；

3、上样时要避免飘样，回收多个样时，样与样最好隔一个上样泳道。

切胶时应小心，不要切过大或过小，尽量与条带的形状及大小一致；

4、切胶时要迅速，尽量减少紫外光对回收片断的损伤，一般要用长波紫外灯。

5、胶在溶解时，应该摇晃几次；

6、对于小于500bp的片断要在胶的溶液中加入1/3体积的异丙醇。

实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备

一、实验目的

学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；掌握将外源DNA（如连接产物或重组质粒等）导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

受体细胞制备的方法有电击法，CaCl2等化学试剂法等。

CaCl2法的原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。

如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

二、试剂配制和器材准备

所需工程菌：

大肠杆菌DH5菌株

试剂和耗材：

LB培养基、卡那霉素储存液等

公用仪器及试剂：

超净工作台2台，LB培养基，蛋白胨1瓶，酵母提取物1瓶，NaCl1瓶，THZ-C水平摇床2台，冷冻离心机1台，甘油，100mL，CaCl21瓶，

分组仪器及试剂：

移液