宏基因组实验计划.docx

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宏基因组实验计划

宏基因组实验计划

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宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划

起草人：

李浩宇

宏基因组学研究方向及意义

研究：

环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。

发掘:

环境应激和应答基因的多态性。

探究：

多态性基因的功能。

实验大体步骤:

I.环境样品的采集:

1）避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。

2）样品的迅速处理保存。

有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。

带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液（多为PBＳ）重悬，离心收集沉淀。

分装成小份,冻存于液氮或者‐80℃冰箱中，避免反复冻融。

3）如果后续用间接法提取总ＤＮA的话,此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。

IＩ.DNA提取方法的选择：

总ＤNＡ的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。

直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。

间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。

两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。

直接提取法的优缺点:

直接提取法多用在提取固体样品（如土壤、污泥、湖泊沉积物等）　总DNA的试验中。

其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。

造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DＮA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。

在样品较珍贵时多采用此法。

其缺点同样明显,所得DＮA　的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得ＤNＡ　呈现黄褐色甚至黑色。

可以考虑MoBiｏ和Ｅpicenｔre的DＮＡ提取的商业试剂盒（主要用于提取土壤样品）。

间接提取法的优缺点:

间接提取法则既可以用来提取固相样品总ＤNA　也可以用来提取液体样品总DNＡ。

在提取液体样品（如海水、河流等样品）总DNA时，需要用抽滤的方式浓缩。

与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取ＤNA纯度高，既使在提取固体样品微生物总DＮA时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。

其缺点是DＮA得率低。

ﻫ

土壤ＤNA直接提取法：

（1）　从超低温冰箱中取出保存样品（5ｇ）;

（２）于室温融化；

（３）　加入1３.５　mlCTAＢ　抽提缓冲液和5０μl蛋白酶Ｋ贮存液;

（4）离心管于37oC２25ｒpm水平振荡30mｉn;

（５）加入1．5mL20%ＳDS;

（6）６5oC水浴2h,每隔15mｉn轻轻颠倒数次;

（7）室温6,0０0g离心1０　min,收集上清液,转移至一个新的50　ml离心管中;

（8）沉淀中再加入4．5ｍｌ提取液和０.5ｍl2０%SＤS，轻轻涡旋至混匀;

（9）　浸入液氮中冷冻3mｉｎ　后，于沸水中煮沸3min;

（１0）　室温6,000g　离心10miｎ，收集上清液，与上次上清液合并；

（1１）　重复（8）、（９）、（1０）一次;

（12）将三次提取所获上清液与等体积的苯酚:

氯仿（1:

１v/v）混合,摇匀后于4℃

12，０0０g离心10min；

（１3）将上层水相转移至一新的50ｍｌ离心管中,加入等体积的氯仿：

异戊醇（24:

１），

混匀后于4　℃１２,000g离心10miｎ；

（14）　再次转移上清至一新的离心管中，加入0.６　倍体积的异丙醇于室温沉淀1h;

（１5）室温12,00０g离心２０min；

（16）收集沉淀,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；

（17）向离心管中加入１mlTＥ，于4℃放置过夜,分装保存于‐20　℃。

实验过程中的注意事项及一些技巧:

ﻫﻫ

（1）整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡（试剂盒提取除外）。

ﻫ

（2）用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。

ﻫ（３）酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。

（4）　异丙醇沉淀时不要放在低温,０.7倍体积室温沉淀足够了。

（5）ＤNA　溶解时可以放在4℃静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。

ﻫ（6）　水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。

水样DＮA间接提取法:

（1）抽滤的方式浓缩采集到的水样。

（2）采取差速离心取得水样中的菌体。

（3）取得微生物后进行裂解提取。

此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。

例如:

用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。

会不会有ＤNＡ的丢失等等。

Ｅｐｉcｅｎtre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（MｅｔａgｅnｏｍiｃDNＡＩｓoｌaｔionKitfor　Watｅr）,能从水样中分离已随机剪切的,可直接用于fosmiｄ克隆的DＮA片段。

此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物（包括革兰氏阳性菌）中提取4０ｋb大小的DNA。

提取的DNＡ可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Ｅpiceｎtre的ＰCC１ＦＯS载体上。

优势:

１．无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。

2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。

３.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。

4．Fosｍｉｄ载体与DＮA的克隆只需要90分钟。

下图为方法与流程：

粗提DＮA的纯化

采用直接提取法提取的总DNA　或多或少都含有腐殖质的存在。

它的存在对后续的分子生物学操作会有影响,时常会导致ＰＣR扩增不出来,酶切困难,连接转化率低。

需要进行纯化。

纯化的方法包括:

胶回收，柱纯化,电泳/电洗脱，梯度离心。

a胶回收

胶回收最大的优点在于快捷,可以在很短的时间内完成。

纯化后的DＮA　往往能够满足ＰCR　要求。

但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DＮA　分子造成机械损伤,使得DNＡ弥散，完整度下降。

如果后续的实验室分析16SrDNA,则这种纯化方式不失为一种好方法。

ﻫ

b　柱纯化

柱纯化相对于胶回收来说更为快速,十几分钟内可完成。

与胶回收相比，其纯化效果要差一些。

但通常情况下，纯化之后的ＤNA　也能够满足ＰCＲ需求。

这种方法也会造成ＤNＡ分子的机械损伤，使得DNA弥散,完整度下降。

ﻫ

c电泳／电洗脱

电泳／电洗脱法相对于前两种有很多优点：

其一,其价格低；其二,整个过程都很温和,能够保证DNA的完整性;其三,纯化后的DNA纯度较之前两种要好一些。

但是其亦有些许不便:

其一,过程耗时长，包括透析袋的准备,电洗脱,洗脱液的浓缩等;其二,DNＡ损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。

如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metａgenoｍic研究，这种方法不失为一种好方法。

如果有脉冲场凝胶电泳系统,用此方法可以得到高纯大片段DNＡ,可以满足后续的metagenomiｃ　C／Fosｍｉｄ　文库构建。

d蔗糖/氯化铯密度梯度离心

如果实验室有超速离心机（1０0,０0０ｇ以上）,那么这种方法无疑也是一种好方法。

与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA及杂质进行分离，可以很好的纯化DＮA。

纯化得到的DNＡ经过低熔点凝胶电泳切胶回收,可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的ｍｅtagｅnｏmｉcC／Fｏｓmｉｄ文库构建。

纯化质量的检测

ＤNＡ纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：

其一,完整度判断；其二,纯度判断。

a　完整度判断

完整度判断同前所述,千万要记得的是加纯化之前的DＮA　样品做对照。

结果可以告诉我们纯化得率及完整度。

同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。

b纯度判断

纯度判断通常可以采用两种方法:

分光光度计法和PCR扩增法。

分光光度计可以测定双链DＮＡ在2６0nｍ处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。

通过不同波长吸收值的比,可以对DNＡ　纯度做出判定。

通常这种方法由于灵敏性较高,所以在存在杂质时误差较大。

IIＩ．所提ＤNＡ完整性检测

ＤNA的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。

最好采用0．8％琼脂糖凝胶电泳,低电压长时间跑。

至少要用laｍbｄaDＮA／Ｈｉnd　III做marker,如果在23kb处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA完整性尚好。

如有条件,可以采用脉冲场凝胶电泳对提取ＤNA　的完整度进行分析。

用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个ｍaｋeｒ，至少还应该有完整lambｄａDNA（约４8kb）充当另一个makeｒ。

以上为送测序前样品的采集，DNA的提取,验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。

Ｉllumina所进行的测序是由GｅnomeＡnaｌyzer测序仪所完成的：

以上为Genoｍe　Ａnalyzer技术的基本原理

IV.在DNA提取,检验完成后送BGI进行后续测序。