高中生物技术与生物工程基因工程和蛋白质工程第1节基因工程的原理学案.docx

高中生物技术与生物工程基因工程和蛋白质工程第1节基因工程的原理学案.docx

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高中生物技术与生物工程基因工程和蛋白质工程第1节基因工程的原理学案

第一章　基因工程和蛋白质工程

第一节　基因工程的原理

1．简述基因工程的诞生。

2．简述基因工程的原理及技术。

（重点）

3．尝试DNA的提取与鉴定。

（难点）

基因工程的诞生与操作工具

1．诞生历程

时间

科学家

事件

1967年

发现了DNA连接酶

1970年

史密斯等

首次提取出核酸限制性内切酶

提取了T4DNA连接酶

1972年

伯格等

构建了世界首例体外重组的杂合DNA分子

1973年

科恩等

成功培育出双重抗性大肠杆菌

2.操作工具

（1）核酸限制性内切酶——“基因手术刀”

（2）DNA连接酶——“基因缝纫针”

①作用：

将两个DNA片段连接起来，修复被限制性内切酶切开的切口，拼接成新的DNA分子。

②种类：

T4DNA连接酶（把限制性内切酶切开的黏性末端的缝隙“缝合”起来）。

（3）载体——“分子运输车”

①载体的特点

ⅰ.外源DNA的插入不影响载体在宿主细胞内的自我复制。

ⅱ.有适宜的限制性内切酶酶切位点，最好是对多种限制性内切酶有单一切点。

ⅲ.具有某些标记基因。

ⅳ.载体应对受体细胞无害。

②载体的种类：

ⅰ.质粒：

它是细菌中独立于细菌DNA之外的小型环状DNA分子。

ⅱ.噬菌体或其他一些病毒。

探讨

：

下图表示限制性内切酶切割某DNA分子的过程，从下图中可知，该限制性内切酶能识别的碱基序列及其切割位点是什么？

提示：

GAATTC，切点在G和A之间。

探讨

：

结合DNA复制的过程分析，限制性内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？

提示：

限制性内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。

探讨

：

如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生了下述变化，则X酶是什么？

提示：

DNA连接酶。

1．核酸限制性内切酶

（1）来源和种类

切割DNA的工具是核酸限制性内切酶，又叫限制酶，这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。

迄今已分离出的约有4000种。

（2）作用

限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（3）识别序列的组成

一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成。

（4）作用结果

当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。

【特别提示】　①限制酶作用的结果通常有两种形式——黏性末端或平末端；

②限制酶的作用特点体现了酶的专一性。

2．DNA连接酶

（1）分类

根据DNA连接酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：

①从大肠杆菌中分离得到的DNA连接酶，称为E·coliDNA连接酶；

②从T4噬菌体中分离出来的DNA连接酶，称为T4DNA连接酶。

（2）作用

这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

【特别提示】　E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。

而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。

3．载体

（1）常用载体——质粒

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型环状DNA分子。

（2）载体的条件

①能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因；

②具有多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合；

③具有标记基因，便于进行检测和筛选。

（3）其他载体

在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

1．下列关于限制酶和DNA连接酶的理解正确的是（　　）

A．其化学本质都是蛋白质

B．DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键

C．在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶

D．它们不能被反复使用

【解析】　限制酶和DNA连接酶的化学本质均为蛋白质，DNA连接酶的作用是将两个DNA片段连接起来，DNA聚合酶的作用是把单个脱氧核苷酸连成脱氧核苷酸链。

【答案】　A

2．核酸限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，核酸限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。

在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。

（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

（3）在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后的片段是否可以连接？

为什么？

【解析】　本题考查核酸限制性内切酶切割DNA的方式，将限制酶能识别的序列写出，再将限制酶切点处标出，可用虚线画出，然后可沿着虚线将片段一分为二，这样便能正确画出核酸限制性内切酶将DNA切出的黏性末端了。

若限制酶切割后产生的黏性末端能互补配对，形成的黏性末端便能连接，否则不能。

【答案】　

（1）

　　　　目的基因

（2）

　　　目的基因

（3）可以连接；因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）。

　基因工程的概念与一般程序

1．概念

基因工程是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。

它可以在分子水平上定向改造生物的遗传性状。

2．一般程序

（1）目的基因的获得

①目的基因：

在基因操作中使用的外源基因。

②获取方法

ⅰ.直接分离法：

直接从基因组中获取目的基因，最常用的方法是“鸟枪法”，又称“霰弹法”。

ⅱ.人工合成法：

主要包括反转录法和化学合成法两种。

（2）重组载体的构建

①方法：

用同一种限制性内切酶分别切割质粒和目的基因，再用DNA连接酶将它们连接起来。

②重组载体的作用：

携带外源DNA分子片段进入受体细胞。

（3）重组载体的导入和筛选

①转化：

将带有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，使之进入受体细胞的过程。

②转化方法

ⅰ.运用载体进行转化。

ⅱ.基因枪法。

ⅲ.显微注射法。

ⅳ.花粉管通道法。

③筛选方法：

利用选择培养基培养转化后的受体细胞。

（4）目的基因的表达和鉴定

通过检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状来进行鉴定。

探讨

：

依据某一蛋白质的氨基酸序列合成的目的基因，其脱氧核苷酸序列是否是唯一的？

提示：

不是。

因为一种氨基酸可能有多种密码子来决定。

探讨

：

采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的有哪些？

①将毒蛋白注射到棉受精卵中　②将编码毒蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中　③将编码毒蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养　④将编码毒蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵

提示：

③④。

探讨

：

如何检测抗虫棉中的毒蛋白基因是否表达？

提示：

让棉铃虫取食抗虫棉，若棉铃虫食后死亡，说明毒蛋白基因表达。

1．目的基因的获取

（1）从基因文库中获取目的基因

①基因组文库：

如果一个基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库就叫做基因组文库。

②部分基因文库：

如果一个基因文库中只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库就叫做部分基因文库，如cDNA文库。

（2）人工合成目的基因有两个途径：

①反转录法：

就是以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成单链DNA，再合成双链DNA。

②直接合成法：

就是以已知蛋白质的氨基酸序列为基础，推出mRNA的核苷酸序列，再推出目的基因序列，然后进行人工合成。

（3）利用PCR技术扩增目的基因

PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较

PCR技术

DNA复制

相同点

原理

碱基互补配对

原料

四种脱氧核苷酸

条件

模板、ATP、酶

不同点

解旋方式

DNA在高温下变性解旋

解旋酶催化

场所

体外复制

细胞核内

酶

热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）

细胞内含有的DNA聚合酶

结果

在短时间内形成大量的DNA片段

形成整个DNA分子

【特别提示】　从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因时，目的基因已存在。

人工合成目的基因时，目的基因从无到有。

2．重组载体的构建

（1）构建目的

其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）构建零件及其作用

①目的基因

②启动子：

一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。

③终止子：

相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。

终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。

④标记基因：

其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。

【特别提示】　由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的。

3．重组载体的导入与筛选

（1）转化：

将带有目的基因的重组载体导入受体细胞的过程。

①过程图解

【特别提示】　上图中b与a相比，b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是：

在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性；而a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因，其优越性在于能有效预防基因污染。

②不同细胞转化的比较

生物种类

植物细胞

动物细胞

微生物细胞

常用方法

花粉管通道法

显微注射法

Ca2＋处理法

受体细胞

体细胞

受精卵

原核细胞

转化

过程

a.用目的基因转化花粉→受精→获得转化植株

b.将目的基因滴在剪开的柱头上，使其沿花粉管进入胚囊，完成转化

将重组DNA分子提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物　

Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子　　

（2）筛选含有目的基因的受体细胞

①原理：

质粒上有抗生素的抗性基因。

②方法：

利用选择培养基筛选。

4．目的基因的表达和鉴定

目的基因导入受体细胞是否能够表达要通过检测来确认，检测的方法有：

（1）分子水平检测：

①导入检测：

DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测。

②表达检测

（2）个体生物学水平鉴定：

对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。

1．下列不属于获取目的基因方法的是（　　）

A．从基因文库中获取目的基因

B．转录法

C．反转录法

D．根据已知氨基酸序列合成法

【解析】　解答此题从如下两个方面入手分析：

①获取目的基因的途径有两条：

一条是直接分离基因，另一条是人工合成基因。

直接分离基因也就是“鸟枪法”，人工合成基因又有两条途径，一条是“逆转录法”，另一条是根据已知氨基酸序列合成基因。

②所谓转录是指以DNA的一条链为模板，遵循碱基互补配对原则，合成mRNA的过程。

此过程不能获得DNA（基因）。

【答案】　B

2．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用载体为质粒A。

已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。

请回答下列问题。

（1）如何将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒（重组DNA分子）?

________________________________________________________________

________________________________________________________________

（2）目前把重组质粒导入细菌细胞时效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。

可以通过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：

将得到的细菌涂抹在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就说明导入了质粒A或重组质粒，反之则没有。

使用这种方法鉴别的原因是

_______________________________________________________________。

（3）若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是__________________________；原因是______

_______________________________________________________________。

（4）导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？

________________________________________________________________

________________________________________________________________

【解析】　

（1）将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒的过程是：

①用一定的限制性内切酶切割质粒A，使其出现一个有黏性末端的切口；②用同种限制性内切酶切割目的基因，产生相同的黏性末端；③将切下的目的基因片段插入到质粒A的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒A与目的基因结合成重组质粒。

（2）检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，均需利用质粒上某些标记基因的特性，即对已经导入质粒或重组质粒的、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有标记基因的相应特性来确定。

抗氨苄青霉素基因在质粒A上，而且它与目的基因是否插入无关，所以，用含氨苄青霉素的选择培养基培养经过导入质粒A处理的受体细胞，凡能生长的则表明质粒A或重组质粒导入成功，不能生长的则无质粒A或重组质粒导入。

（3）抗四环素基因不仅在质粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之处，因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时，此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏，当然含重组质粒的细菌就不能在含四环素的培养基上生长；而质粒A上无目的基因插入，抗四环素基因的结构是完整的，含质粒A的细菌就能在含四环素的培养基上生长。

（4）基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译过程合成出相应的蛋白质，即人的生长激素。

【答案】　

（1）用一定的限制性内切酶切割质粒A，使其出现一个有黏性末端的切口；用同种限制性内切酶切割目的基因，产生相同的黏性末端；将切下的目的基因片段插入到质粒A的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。

（2）普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因

（3）有的能生长，有的不能生长　导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏

（4）细菌细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。

探究活动:

尝试DNA的提取与鉴定

1．实验原理

（1）十二烷基磺酸钠（SDS）能够使蛋白质变性，在研磨液中加入SDS可以使蛋白质与DNA分离。

乙二胺四乙酸二钠（EDTA）为DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA分子被降解。

（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的许多其他物质可以溶于酒精溶液。

利用这一原理，我们可以提取出含杂质较少的DNA。

（3）DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

2．活动程序

（1）DNA的粗提取

①材料准备

将新鲜菠菜和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，冷冻至少24h。

②研磨

称取30g新鲜菠菜叶片，切碎。

将菠菜碎片置于研钵（在冰上操作）中，加入10_mL研磨液，迅速研磨成糊状。

③过滤

在漏斗中垫上尼龙纱布，将菠菜研磨液滤入塑料烧杯中。

④离心

将滤液倒入5_mL塑料离心管中，以1000r/min的速度离心10min。

⑤加冷酒精

从离心管中取出上清液，倒入50mL塑料烧杯中，同时加入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精。

用玻璃棒沿一个方向缓缓地搅拌溶液，溶液中会出现白色丝状物。

用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去上面的水分。

这种丝状物的主要成分就是DNA。

（2）DNA的鉴定

取一支20mL的试管，加入物质的量浓度为0.015mol/L的NaCl溶液5mL。

将得到的丝状物放入试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。

然后，向试管中加入4mL二苯胺试剂，混匀后用沸水浴（100℃）加热10min。

在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化。

探讨

：

如果实验材料改为鸡的血细胞，还需研磨吗？

为什么？

提示：

不需要，因为动物细胞无细胞壁。

探讨

：

在准备材料时，为什么要将菠菜叶片和酒精溶液进行预冷处理？

提示：

菠菜叶片预冷处理有利于破碎细胞；酒精溶液预冷处理有利于溶解DNA之外的其他物质从而提取含杂质较少的DNA。

探讨

：

在DNA提取过程中所用的容器为什么必须是塑料的而不是玻璃的？

提示：

由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基也带电荷而容易被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少DNA损失。

1．DNA提取过程中需要的物质及作用

SDS

使蛋白质变性，从而使蛋白质与DNA分离

EDTA

防止细胞破碎后DNA分子被DNA酶降解

冷酒精

溶解DNA分子以外的其他物质，提取出含杂质较少的DNA

0.015mol/L

的NaCl溶液

溶解DNA

2.DNA粗提取实验成功的关键及注意事项

（1）在破碎细胞释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，应不少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min。

（2）用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的是95%的酒精，且必须经过充分预冷后才能使用。

（3）在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插入烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。

1．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是（　　）

A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料

B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水

C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物

D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝

【解析】　酵母菌和菜花细胞的细胞核都含有DNA，可作为提取DNA的材料，A项正确；DNA能溶解在不同浓度的NaCl溶液中，且溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，在利用渗透作用原理向生物材料中加入蒸馏水时，一方面促使细胞吸水涨破，另一方面释放出的DNA也溶解在蒸馏水中，B项正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，目的是加快细胞吸水涨破，释放其中的DNA，而DNA则溶解在蒸馏水中，因此玻棒上不可能有白色絮状物，C项错误；DNA溶液与二苯胺试剂经沸水浴加热会变蓝，D项正确。

【答案】　C

2．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下。

材料处理：

称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10g。

剪碎后分成两组，一组置于20°C、另一组置于－20°C条件下保存24h。

DNA粗提取：

第一步：

将上述材料分别放入研钵中，各加入15mL研磨液，充分研磨，用两层纱布过滤，取滤液备用。

第二步：

先向6只小烧杯中分别注入10mL滤液，再加入20mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地沿一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。

第三步：

取6支试管，分别加入等量的0.015mol/LNaCl溶液溶解上述絮状物。

DNA检测：

在上述试管中各加入4mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热10min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。

材料保存温度

花菜

辣椒

蒜黄

20°C

＋＋

＋

＋＋＋

－20°C

＋＋＋

＋＋

＋＋＋＋

（注：

“＋”越多表示蓝色越深）

分析上述实验过程，回答下列问题。

（1）该探究性实验课题名称是________________________________________

_______________________________________________________________。

（2）第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__________________________。

（3）根据实验结果，得出结论并分析。

①结论1：

与20°C相比，相同实验材料在－20°C条件下保存，DNA的提取量较多。

结论2：

_________________________________________________________

_______________________________________________________________。

②针对结论1，请提出合理的解释：

___________________________________

_______________________________________________________________。

（4）氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。

为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是______________________________________

_______________________________________________________________，

然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。

【解析】　

（1）分析表格可知，实验目的在于探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。

（2）DNA分子为链状，很容易断裂，所以应缓缓地沿一个方向搅拌。

（3）分析表格可看出，同种材料在－20℃时DNA提取量较多，不同材料在同种温度下保存时，蒜黄的DNA提取量最多。

低温下酶活性较低，DNA降解慢。

（4）根据题意，可用氯仿将DNA溶液中的蛋白质析出，进一步提高DNA的纯度。

【答案】　

（1）探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响

（2）DNA断裂

（3）①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多　②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢

（4）将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液

1.在基因工程中用来修饰、改造生物基因的工具是（　　）

A．限制酶和水解酶

B．限制酶和DNA连接酶

C．限制酶和载体

D．DNA连接酶和载体

【解析】　在基因工程中常用限制酶对DNA分子进行切割，用DNA连接酶把不同的DNA片段连接起来，以达到改造DNA的目的。

【答案】　B

2．下列操作中不属于重组载体构建过程的是（　　）

A．用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端

B．用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端

C．将切下的目的基因片段插入质粒切口处

D．将重组D