版高考生物一轮复习生物技术实践第1讲无菌操作技术学案苏教版.docx
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版高考生物一轮复习生物技术实践第1讲无菌操作技术学案苏教版
第1讲 无菌操作技术
考纲要求
全国卷五年考情
1.微生物的分离和培养
2017·卷ⅠT37，2016·卷ⅠT39，2016·卷ⅢT39，2015·卷ⅠT39，2014·卷ⅠT39
2014·卷ⅡT39，2013卷·ⅡT39
2.某种微生物数量的测定
2016·卷ⅠT39，2015·卷ⅠT39
3.培养基对微生物的选择作用
2014·卷ⅠT39，2013·卷ⅡT39
考点一|微生物的分离和培养
（对应学生用书第227页）
[识记—基础梳理]
1．相关技能、技术和方法
（1）无菌操作的技能——灭菌
①分类：
实验室常用高温处理达到灭菌效果，包括干热灭菌和湿热灭菌。
②作用：
微生物分离和培养的基础。
③关键：
防止外来杂菌的入侵。
（2）配制培养基
①培养基概念：
为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养物质。
②分类：
按化学性质的不同分为天然培养基和合成培养基。
（3）接种微生物
①接种：
指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。
②接种方法和常用工具（连线）
接种方法 常用工具
Ⅰ.涂布平板接种 a．接种针
Ⅱ.穿刺接种 b．接种环
Ⅲ.斜面接种c．玻璃涂布器
Ⅳ.平板划线接种
[答案] Ⅰ－c Ⅱ－a Ⅲ－b Ⅳ－b
2．大肠杆菌的接种与分离培养
（1）配制牛肉膏蛋白胨培养基
其操作步骤：
配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。
（2）斜面接种和培养大肠杆菌
①主要目的：
菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。
②主要步骤：
准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37_℃恒温箱中培养大肠杆菌24h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中（4℃）保存。
（3）平板划线分离和培养大肠杆菌
①平板的作用：
培养、分离细菌等微生物。
②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。
[理解—深化探究]
1．微生物的培养基
（1）培养基的成分
营养要素
来源
功能
碳源
无机碳源
CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物
a.构成细胞物质和一些代谢产物
b.既是碳源又是能源（有机碳源）
有机碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等
氮源
无机氮源
无机氮：
NH3、铵盐、硝酸盐、N2等
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
有机氮源
牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸
生长因子
维生素、氨基酸、碱基
a.酶和核酸的组成成分
b.参与代谢过程中的酶促反应
水
培养基、大气、代谢产物
不仅是良好的溶剂，还是结构物质
无机盐
培养基、大气
细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养型细菌的能源；酶的激活剂
（2）培养基的分类
种类
特点
应用
物理
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
性质
固体培养基
加凝固剂
微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏
化学成分
天然培养基
含化学成分不明的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确或用一定化学物质配制
分类、鉴定
用途
选择培养基
添加某物质，抑制杂菌生长，促进所需微生物生长
培养分离出特定微生物
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂
鉴别微生物
2.无菌技术
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
3.微生物培养中的几个图形分析
图一
图二
（1）图一为倒平板操作过程。
操作时要待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。
温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。
平板冷却凝固后需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。
（2）图二为系列稀释操作。
注意移液管需要经过灭菌。
操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2cm处。
4．微生物纯化培养过程结果分析
（1）B区域出现了单个菌落，产生每个菌落的最初细菌数目是1。
（2）在培养基上划线接种时，划线的顺序依次是A→C→B。
[运用—考向对练]
◎考向 微生物的分离和培养
1．（2018·吉林长春二模）下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。
实验步骤：
①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。
②待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。
③在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。
请回答：
（1）配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、________、________的要求。
（2）从功能上看，含有链霉素的培养基属于________培养基。
若在培养基中加入伊红和美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为________。
由图可知，1号培养基接种的方法为______________________。
（3）对2和3进行比较，在2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到____________（填“含链霉素”或“不含链霉素”）的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之________（填“前”或“后”）。
（4）3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明了基因突变具有________的特点。
[解析]
（1）配制培养基时在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
（1）链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。
在伊红和美蓝培养基上，大肠杆菌菌落颜色为黑色。
由题图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。
（3）培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，将培养基2中一个相应菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。
（4）抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状，3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了基因突变频率很低。
[答案]
（1）pH 氧气
（2）选择 黑色 稀释涂布平板法
（3）含链霉素 前
（4）频率低、低频性
2．（2018·江西赣中南五校第一次联考）下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。
【导学号：
41780164】
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
指示剂
琼脂
含量（g）
10.0
5.0
5.0
2.0
0.2
12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于__________。
（2）若根据用途划分，该培养基属于__________（填“选择”或“鉴别”）培养基。
若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？
________________，并用__________作为指示剂。
（3）在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行__________；操作者的双手需要进行清洗和__________。
（4）图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：
______________和______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的__________。
图1 图2
[解析]
（1）大肠杆菌只能从环境中摄取有机物，不能自己合成有机物，属于分解者。
（2）该培养基中含有指示剂，属于鉴别培养基。
尿素分解菌可以分解尿素，而其他微生物不能，因此可将培养基中的蛋白胨改为尿素用于筛选土壤中的尿素分解菌，并用酚红作为指示剂，尿素分解菌分解尿素产生了NH3可使酚红变红。
（3）培养微生物时，培养基和培养皿需要灭菌，操作者双手需要进行消毒。
（4）图1采用的是稀释涂布平板法，图2采用的是平板划线法。
单个微生物细胞繁殖所形成的细胞群叫菌落。
[答案]
（1）分解者
（2）鉴别 将蛋白胨改成尿素 酚红 （3）灭菌 消毒 （4）稀释涂布平板法 平板划线法 菌落
[规律总结]关于培养基的理解
考点二|微生物的分离和计数
（对应学生用书第229页）
[识记—基础梳理]
1．分离特定微生物的知识准备
（1）区分涂布平板法和混合平板法
①区分两种平板法过程图
②结果不同
a．涂布平板法：
细菌菌落通常仅在平板表面生长。
b．混合平板法：
细菌菌落出现在平面表面及内部。
③目的相同：
分离各种目的微生物。
（2）选择培养分离
①方法：
针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。
②原理：
不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。
③用途：
从众多微生物中分离出特定的微生物。
（3）菌落
①概念：
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
②特征：
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。
2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）培养基
采用唯一氮源为尿素的培养基。
（2）统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用涂布平板法。
（3）实验流程
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
3．纤维素分解菌的筛选
（1）原理
纤维素分解菌
↓
―→红色复合物
红色消失，出现透明圈。
（2）筛选方法：
刚果红染色法。
（3）标志：
以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
（4）实验流程
：
富含纤维素的环境
↓
：
用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
：
制备系列稀释液
↓
：
将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
：
透明圈的菌落
4．显微镜直接计数法
（1）原理：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
（2）缺点：
不能区分死菌还是活菌。
（3）1mL培养液中菌体的总数换算公式为：
①16×25型的血球计数板：
1mL悬液中待测标本（菌体）数＝
×400×104×稀释倍数。
②25×16型的血球计数板：
1mL悬液中待测标本（菌体）数＝
×400×104×稀释倍数。
[理解—深化探究]
平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同
1．第一次操作：
杀死接种环上原有的微生物。
2．每次划线之前：
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。
3．划线结束后：
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
4．稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。
这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。
5．平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。
[运用—考向对练]
◎考向1 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1．（2018·湖南郴州第四次质检）分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。
请回答下列问题：
（1）分解尿素的微生物含有的酶是________；配制培养基时应以________作为唯一氮源。
（2）培养基中添加________作为指示剂，培养后，培养基pH会________（填“升高”或“降低”），可使指示剂变红色。
（3）对尿素溶液进行灭菌的最适方法是____________________________。
（4）该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是_____________________________________________；
然后将1mL样液稀释10000倍，在3个平板上用涂布法分别涂布0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。
据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
[解析]
（1）分解尿素的微生物含有的酶是脲酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。
（2）在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶分解尿素可产生氨，氨会使培养基的pH升高，进而使酚红指示剂变红。
（3）对尿素溶液进行灭菌的最适方法是过滤法。
（4）在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数＝（C÷V）×M＝[（39＋42＋45）÷3]÷0.1×10000＝4.2×106（个）。
[答案]
（1）脲酶 尿素
（2）酚红 升高 （3）过滤法 （4）检测培养基平板灭菌是否合格 4.2×106
◎考向2 分解纤维素的微生物的分离
2．（2014·全国卷Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
回答下列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成________色复合物。
用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：
“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________
______________________________________________________________；
培养基乙________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________________。
[解析]
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。
（2）刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
（3）纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
[答案]
（1）纤维二糖 葡萄糖
（2）红 透明圈
（3）不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
[技法总结]选择培养基和鉴别培养基的比较
类型
实例
选择
培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
鉴别培养基
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物
伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈深紫色并带金属光泽）
真题验收|感悟高考 淬炼考能
（对应学生用书第231页）
1．（2017·全国卷Ⅰ）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。
回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。
能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是
______________________________________________________________
______________________________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________（答出两点即可）。
[解析]
（1）有些细菌能分解尿素是因为这些细菌能产生脲酶，将尿素分解成CO2和NH3。
能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2作为碳源合成有机物，但这些细菌可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：
作为能源物质氧化分解为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，这样只有能分解尿素的细菌才能在培养基上生存。
若选择“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作为氮源，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，它们可以为细菌生长提供无机营养；同时，KH2PO4和Na2HPO4还可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。
[答案]
（1）脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
（2）尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用 （3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．（2016·全国卷Ⅰ）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。
某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。
实验步骤如下：
①配制培养基（成分：
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于________。
若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
（2）步骤③中，实验组的操作是________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。
若将30（即36－6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________（填“正确”或“不正确”）。
[解析]
（1）牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。
若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。
（2）该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。
（3）若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。
空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。
[答案]
（1）牛肉膏、蛋白胨 琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 （3）污染 不正确
3．（2016·全国卷Ⅲ）某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。
分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。
回答下列问题：
（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是______________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________。
（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有____________和______________。
分离纯化时应挑选出________的菌落作为候选菌。
（3）乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________（填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。
[解析]
（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。
（2）乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢（无氧呼吸）过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。
（3）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。
将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
[答案]
（1）无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落
（2）鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸（或酸） 具有透明圈 （3）甘油
1．掌握无菌操作技能是进行微生物分离与培养的基础；掌握微生物培养基的配制技术和微生物接种和培养的方法是实现微生物分离和培养的必要条件。
2．灭菌主要包括干热灭菌和湿热灭菌，前者在干热灭菌箱内进行，后者常用高压蒸汽灭菌锅进行。
3．培养基的制备包括计算、称量、熔化、灭菌、倒平板等步骤，平板倒置的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。
4．微生物接种常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
5．统计菌落数目的方法有显微镜直接计数法和间接计数法。
微生物的间接计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。
6．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
7．植物组织培养包括脱分化和再分化等过程，培养过程除了需要各种营养物质外，还需要植物激素的调节。
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