TM083细菌内毒素检查法总结.docx
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TM083细菌内毒素检查法总结
细菌内毒素检查法
起草人
审核人
审核人
批准人
部门
QC
QA
QC
质量管理部
姓名
饶涛
黄祥彪
汪大才
邓志军
签名
日期
分发部门：
质量管理部QC
1.目的
建立细菌内毒素检查的标准操作程序,规范细菌内毒素的检验操作。
2.范围
细菌内毒素检查。
3.职责
QC
4.操作内容
4.1简述；
4.1.1本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法。
4.1.2鲎试剂灵敏度复核试验项的目的不仅是考察鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.1.3供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
4.1.4检查法项为供试品细菌内毒素检查方法，阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
4.2实验材料及用具
4.2.1电热干燥箱
除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
4.2.2试管恒温仪，精度在±0.2℃。
在37℃±1℃保持一小时。
4.2.3旋涡混合器
4.2.4鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。
4.2.5细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（CSE），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
4.2.6细菌内毒素检查用水（BET水）
系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。
其内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
4.2.7实验用具
移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿须经250℃干烤至少l小时。
塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。
4.2.8试剂
75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
4.3操作方法
4.3.1试验准备
4.3.1.1洗液的配制
见“玻璃仪器的清洁标准操作规程”
4.3.1.2玻璃器皿的洗涤
将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
4.3.1.3除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。
达到规定时间后，关断电源。
待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在三天内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。
4.3.2鲎试剂灵敏度复核
在使用每一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
4.3.2.1内毒素标准溶液的制备
4.3.2.1.1取CSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。
4.3.2.1.2按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口，封严。
置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。
若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。
若为CSE，为一次性使用。
在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。
4.3.2.2待复核鲎试剂的准备
4.3.2.2.1在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。
用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
4.3.2.2.2若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.lml分配到10~75mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。
4.3.2.3加样
4.3.2.3.1将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支（管）l列分别加入BET水。
内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。
4.3.2.4加样结束后，轻轻混匀，避免产生气泡，放人37±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观察结果。
4.3.3干扰试验
4.3.3.1供试品细菌内毒素限值（L）的确定。
4.3.3.1.1按供试品标准规定限值
4.3.3.1.2尚无标准规定的供试品内毒素限值，一般按以下公式确定，特殊情况下，可根据生产和临床用药实际做必要调整。
L＝K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。
以EU/kg/hr表示。
注射剂，K＝5EU/kg/hr，其中放射性药品注射剂K＝2.5EU/kg/hr，鞘内用药品，K＝0.2EU/kg/hr。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或U/（kg.ｂ）表示，中国人按人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时，按1小时计。
4.3.3.2供试品最大有效稀释倍数的计算：
MVD＝C·L/λ
L为供试品的细菌内毒素限值，λ为测试用鲎试剂的灵敏度标示值，C表示供试品的浓度，或供试品复溶后所得溶液的浓度。
当L以EU/ml表示时C为1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/u表示时，C为mg/ml或u/ml。
如需计算供试品的测试浓度C，可设MVD为1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
4.3.3.3内毒素标准溶液的制备同4.3.2.1。
4.3.3.4含供试品的内毒素溶液的制备
4.3.3.4.1根据供试品的限值（L）和使用鲎试剂的灵敏度（λ）计算供试品测试浓度（C）或MVD。
4.3.3.4.2将供试品稀释，其稀释倍数不应超过MVD，并通过预试验确定正式试验供试品测试浓度。
4.3.3.4.3在制备内毒素标准溶液的同时用未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数的稀释液将CSE以相同方法制备成所需浓度的含供试品的细菌内毒素溶液（2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ）。
以注射用头孢哌酮钠（1g/vial）为例：
取约9.2mlBET水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg/ml（冻干品或无菌粉末用BET水溶解后体积若有变化，应根据具体情况定），再将其稀释20倍（即5mg/m1）后备用：
可用0.3ml（100mg/ml）+5.7ml（水）→5mg/ml。
取4.3.3.3制备好的内毒素标准溶液0.3ml加上2.7ml5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为1→10内毒素稀释液。
0.4ml1→10稀释液加上3.6ml5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为1→100内毒素稀释液。
其余依次类推。
也可写成下列格式：
9000EU/ml
0.3ml
900EU/ml
0.3ml
90EU/ml
0.3ml
9EU/ml
0.3ml
1EU/ml
1ml
2.7ml
2.7ml
2.7ml
2.4ml
1ml
0.5EU/ml
1ml
0.25EU/ml
1ml
0.125EU/ml
1ml
0.0625EU/ml
1ml
0.03125EU/m
1ml
1ml
1ml
1ml
4.3.3.4.4简化法制备含供试品的细菌内毒素溶液
取0.5ml内毒素标准液（1.0EU/m1）+0.5ml供试品溶液（10mg/m1）→lml0.5EU/ml（5mg/ml）含供试品的内毒素溶液。
同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml和0.125EU/ml的内毒素标准溶液加入0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液制备0.25EU/ml、0.0125EU/ml和0.0625EU/ml含5mg/ml浓度的供试品阳性对照溶液（其体积大小根据试验所需量而定）。
4.3.3.5鲎试剂的准备
4.3.3.5.1在制备内毒素标准对照溶液和含供试品的内毒素溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂36支轻弹瓶壁使粉末落人瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦试后启开，防止玻璃屑落人瓶内，加0.1mlBET水复溶，轻轻摇动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
4.3.3.5.2若鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的鲎试剂混匀后每0.1m1分配到10～75mm凝集管中，要求至少分配36管备用。
4.3.3.6加样
4.3.3.6.1将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准对照溶液，2支（管）1列加BET水。
4.3.3.6.2将准备好的另外18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含供试品的内毒素溶液：
2支（管）l列加入供试品溶液。
4.3.3.6.3内毒素标准溶液和BET水、含供试品的内毒素溶液和供试品溶液的加样量均为0.1ml。
4.3.3.7加样结束后，轻轻混匀，避免产生气泡，放入试管恒温仪中，保温60±2分钟后观察结果。
4.3.3.8在进行正式干扰试验前可进行预试验，用L和λ（通常用0.5～0.03EU/m1）计算出C的范围，以l：
2的浓度比例，制备含2λ和0.25λ的系列浓度供试品溶液，每一浓度取2支（管）鲎试剂进行试验，判定无干扰浓度进行正式干扰试验。
4.3.4供试品细菌内毒素的检查
4.3.4.1供试品溶液的制备
4.3.4.1.1计算MVD＝C·L/λ
C、L、λ的意义同4.3.3.2
4.3.4.1.2稀释其稀释倍数不得超过MVD。
4.3.4.2阳性对照溶液的制备
按4.3.2.1用检查用水（BET水）将制成2λ浓度的内毒素溶液。
4.3.4.3供试品阳性对照液的制备
用被测供试品将（内毒素工作标准品）CSE制成2λ浓度的内毒素溶液。
方法同4.3.3.4含供试品的内毒素溶液制备。
其中利用简化法时，由于供试品原液必须稀释一倍，采用的鲎试剂灵敏度要提高一倍（如输液），供试品浓度也相应调正。
4.3.4.4鲎试剂的制备
4.3.4.4.1在制备供试品溶液、内毒素标准溶液和供试品阳性对照溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂8支，手指轻弹瓶壁，使颈部瓶壁上的粉末落入瓶内，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内，加入0.1mlBET水复溶，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
4.3.4.4.2若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1m1分配到10×75mm凝集管中，要求至少分配8管备用。
4.3.4.5加样
取装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.lml/支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，2支加入0．1ml用BET水将CSE制成的2λ浓度的内毒素溶液作为阳性对照，2支加入0.1mlBET水作为阴性对照，2支加入0.lml供试品阳性对照溶液（相当于用被测供试品溶液将CSE制成2入浓度的内毒素溶液）作为供试品阳性对照管。
4.3.4.6将试管中溶液轻轻混匀后，垂直放入37±1℃试管恒温仪中，保温60±2分钟。
保温和拿取试管过程应避免受到震动，造成假阴性结果。
4.3.4.7将试管从试管恒温仪
中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。
4.4实验结果计算
4.4.1鲎试剂灵敏度复核
如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
λc=lg-1（∑X/4）
式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
4.4.2干扰实验
如标准溶液最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0．25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。
Es=lg-1（∑Xs/4）
Et=lg-1（∑Xt/4）
式中Xs、Xt分别为BET水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（1g）。
4.5结果判断
4.5.1鲎试剂灵敏度复核
当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
4.5.2干扰实验
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且当Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，否则使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大倍数稀释，这是排除干扰因素的简单有效的方法（也可采用过滤法，干扰因素去除法等其他方法）。
建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上生产厂家的鲎试剂进行干扰试验。
若各批供试品干扰实验结果差别较大时应考虑供试品内毒素的影响。
若鲎试剂的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重复进行干扰实验。
4.5.3供试品细菌内毒素检查
供试品2管均为（－），应认为符合规定。
如2管均为（+），应认为不符合规定；如2管中1管为（+），l管为（－），按上述方法另取4支供试品复试，4管中l管为（+），即认为不符合规定。
若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管为（+）或2管中l管为（+），l管为（－）时，按同样方法复试和判定，复试时要求将其稀释至MVD。
阳性对照为（－）或供试品阳性对照为（－）或阴性对照为（+），试验无效。
4.6结果计算和判断举例
4.6.1鲎试剂灵敏度复核
设待复核的鲎试剂的标示灵敏度为0.125EU/ml。
内毒素浓度EU/ml
0.25
0.125
0.0625
0.03125
N
反应终点
浓度
重
复
管
数
1
+
+
－
－
－
0.125
2
+
－
－
－
－
0.25
3
+
+
+
－
□
0.0625
4
+
+
－
－
□
0.125
λ=lg-1（∑Xs/4）
=lg-1〔（lg0.125+lg0.25+lg0.0625+lg0.125）/4〕
=0.125（EU/ml）
λs在0.5λ～2.0λ范围内，符合规定。
其灵敏度为标示灵敏度0.125EU/ml。
4.6.2干扰实验
设所用鲎试剂的标示灵敏度为0.125EU/ml，供试品为××注射液（1→4）。
内毒素浓度EU/ml
0.25
0.125
0.0625
0.03125
N
反应终点
浓度
1
内毒素标准溶液
+
+
－
－
－
0.0625
2
+
+
－
－
－
0.0625
3
+
+
－
－
□
0.0625
4
+
+
－
－
□
0.0625
1
含供试品的内毒素溶液
+
－
－
－
－
0.25
2
+
－
－
－
－
0.25
3
+
－
－
－
□
0.25
4
+
+
－
－
□
0.125
λ=lg-1（∑Xs/4）
=lg-1〔（lg0.0625+lg0.0625+lg0.0625+lg0.625）/4〕
=0.625（EU/ml）
Et=lg-1（∑Xt/4）
=lg-1〔（lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.125）/4〕
=0.210（EU/ml）
虽然Es在0.5λ～2.0λ范围内，Et不在0.5Es～2.0Es范围，该供试品在1→4浓度下有干扰，需进行适当处理后重复试验，或对供试品进行更大倍数稀释后进行干扰试验。
4.6.3供试品细菌内毒素检查
设所用鲎试剂的标示灵敏度为0.125EU/ml，供试品为××注射液（1→4）。
供试品管
供试品管
阴性对照
2.0λ阳性对照
供试品阳性对照
－
－
－
+
－
结果是否有效
无效
计算结果
无效
结果判断
需重做
检验人员签名
4.7注意事项
4.7.1实验前，须用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒。
4.7.2实验时，须戴工作帽和口罩。
尤其在配制洗液和洗涤玻璃器皿时一定要戴手套、工作帽和口罩。
4.7.3试验应在洁净室或洁净工作台内进行，过程中应防止微生物的污染。
4.7.4用移液管或刻度吸管等吸取样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，防止唾液溅入，防止气体中的内毒素进入供试液。
也可使用加样器等其它方法。
4.7.5注意所用鲎试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等。
4.7.6进行干扰实验时，标准对照和供试品阳性对照（含供试品的内毒素溶液）应同时进行。
4.7.7在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检查时，各个实验所要求的对照应同时进行，并在有效的条件下才能进行计算和判断。
4.7.8溶解鲎试剂及混匀供试品及鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。
4.7.9由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。
5.附件
细菌内毒素检验记录
鲎试剂灵敏度试验记录
干扰试验记录
6.参考文件
中国药典2010版二部附录XIE
7.文件修订历史
版本号
生效日期
修订原因和内容
01
按新版GMP认证修订，替换00版本文件。
鲎试剂灵敏度复核记录
检验目的
检验日期
年月日
检验依据
室温
℃
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
鲎试剂
EU/ml
细菌内毒素工作标准品
中国生物制品检定所
EU/支
细菌内毒素检查用水
---
细菌内毒素工作标准品稀释：
保温时间
～
保温温度
℃
细菌内毒素浓度
EU/ml
2λ
（）
λ
（）
0.5λ
（）
0.25λ
（）
阴性对照
终点浓度
重
复
管
数
1
2
3
4
结果计算
Es=lg-1[（lg+lg+lg+lg）/4]
=
Et=lg-1[（lg+lg+lg+lg）/4]
=
结果判断
干扰试验记录
检品名称
检验日期
年月日
批号
室温
℃
规格
内毒素限值
每中含内毒素不得过EU
检品来源
检验依据
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
鲎试剂
EU/ml
细菌内毒素工作标准品
中国生物制品检定所
EU/支
细菌内毒素检查用水
---
细菌内毒素工作标准品稀释：
供试品制备：
含供试品内毒素溶液的制备：
保温时间
～
保温温度
℃
细菌内毒素浓度
EU/ml
2λ
（）
λ
（）
0.5λ
（）
0.25λ
（）
阴性对照
终点浓度
标
准
对
照
1
2
3
4
含供试品的内毒素溶液
1
2
3
4
结果计算
Es=lg-1[（lg+lg+lg+lg）/4]
=
Et=lg-1[（lg+lg+lg+lg）/4]
=
结果判断
检验人：
复核人：
细菌内毒素检查记录
检品名称
检验日期
年月日
批号
室温
℃
规格
内毒素限值
每中含内毒素不得过EU
检品来源
检验依据
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
鲎试剂
EU/ml
细菌内毒素工作标准品
中国生物制品检定所
EU/支
细菌内毒素检查用水
---
供试品溶液制备：
细菌内毒素标准溶液制备：
EU/支EU/mlEU/mlEU/ml
EU/mlEU/mlEU/mlEU/ml
供试品阳性对照溶液制备：
试验结果
保温温度
℃
试管号
鲎试剂溶液（ml）
供试品溶液
（ml）
内毒素溶液（ml）
检查用水（ml）
供试品阳性对照液（ml）
凝集反应
样品1管
0.1
0.1
样品2管
0.1
0.1
样品3管
样品4管
样品阳性管
0.1
0.1
样品阳性管
0.1
0.1
阳性管
0.1
0.1
阳性管
0.1
0.1
阴性管
0.1
0.1
阴性管
0.1
0.1
结论
本品按《中国药典》2005版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法检查,结果规定。
检验人：
复核人：
升级会员 