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二、论文封面
封面由文头、论文标题、作者、学校、年级、学号、指导教师、答辩组成员、答辩日期、申请学位等项目组成。
文头:
封面顶部居中，占两行。
上一行内容为“河南广播电视大学”用小三号宋体;下一行内容为“汉语言文学专业（本科）毕业论文”，3号宋体加粗。
文头上下各空一行。
论文标题:
2号黑体加粗，文头下居中，上下各空两行。
论文副题:
小2号黑体加粗，紧挨正标题下居中，文字前加破折号。
作者、学校（市级电大）、年级、学号、指导教师、答辩组成员、答辩日期、申请学位等项目名称用3号黑体，内容用3号楷体，在正副标题下适当居中左对齐依次排列。
占行格式为:
作者:
XXX
学校:
XXX年级:
XXX学号:
XXX
指导教师:
XXX职称:
XXX
答辩组成员:
XXX（主持人）职称:
XXX
XXX职称:
XXX
……
答辩日期:
X年X月X日
申请学位:
学士（不申请可省略此项）
由于论文副题可有可无，学位可申请可不申请，答辩组成员可以是3、5、7人，封面内容占行具有不确定性，为保持封面的整体美观，可对行距做适当调整。
三、论文
论文由论文目录（提纲）和题目、作者姓名、完成日期、摘要、关键词、正文、注释、参考文献、附录等项目组成。
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“目录”二字用3号黑体，顶部居中;以下列出论文正文的一、二级标题及参考文献、附录等项及其对应页码。
用小4号宋体。
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作者姓名:
题目下方居中，用四号楷体。
完成时间:
作者姓名下方居中，字样为“X年X月”，用四号楷体。
摘要:
作者姓名下空一行，左起顶头，写明“摘要”字样加粗，点冒号，接排摘要内容。
一般用五号字，字体用楷体。
关键词:
摘要下方，左起顶头，写明“关键词”字样加粗，点冒号，接排关键词。
词间空一字。
字型字体同摘要。
正文:
关键词下空一行开始。
正文文字一般用5号宋体，每段起首空两格，回行顶格，单倍行距。
正文文中标题:
一级标题。
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如果居中，上下各空一行。
二级标题，标题序号为“
（一）”，与正文字体字号相同，独占行，末尾不加标点;
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（1）”和“①”，与正文字体字号相同，一般不独占行，末尾加句号。
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注释:
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参考文献:
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参考文献的项目见“实施方案”正文。
范文一：
Noggin、BMP2和IGF-I对成骨细胞生长的调节作用
中文摘要...IV
英文摘要...V
前言...1
1.BMP蛋白...2
1.1BMP结构和功能...2
1.2BMP诱导成骨机制...2
2.Noggin基因的概况...3
2.1Noggin基因的结构...3
2.1.1Noggin基因结构特征...4
结果...25
致谢...51
参考文献...52
中文摘要
目的：
研究noggin、骨形态发生蛋白2（bonemorphogeneticprotein2，BMP2）、胰岛素样生长因子I（insulinlikegrowthfactorI，IGF-I）对成骨细胞增殖和分化的调节作用。
方法：
1、将人成骨肉瘤细胞MG63于RPMI1640培养基中培养，添加不同浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白进行药物干预，用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl-tetrazolium，MTT）法研究细胞的增殖率。
2、选用最适浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白作用成骨细胞，运用ELISA方法和RT-PCR技术分别检测成骨细胞分化标志物骨碱性磷酸酶（bonealkalinephosphatase,BALP）和骨钙蛋白（osteocalcin,OC）的蛋白含量和mRNA的表达情况。
结果：
1、各药物干预组OD值与对照组相比有统计学差异（P＜0.05），对成骨细胞增殖的作用效应呈剂量和时间依赖性，其作用的最佳时间均在72h。
各药物组内之间比较，确定了最佳作用浓度，BMP2为2×10-9mol/L，对MG63细胞的增殖率达179.59℅；noggin为8×10-9mol/L，对其增殖的抑制率达到15.51℅；IGF-I为1×10-8mol/L，其增殖率达189.80℅。
结论：
BMP2、IGF-I对MG63细胞增殖有促进作用，而noggin则抑制MG63细胞的增殖。
Noggin、BMP2和IGF-I促进BALP的分泌。
Noggin对OC蛋白的分泌有抑制作用，而BMP2、IGF-I则促进OC蛋白的分泌。
关键词：
Noggin蛋白，BMP2蛋白，IGF-I蛋白，成骨细胞，增值，分化
英文摘要
Object:
Theaimsistostudytheeffectsofnoggin,bonemorphogeneticprotein2（BMP2）andinsulin-likegrowthfactorI（IGF-I）ontheproliferationratesanddifferentiationofosteoblasts.
Methods:
ThehumanosteosarcomacelllineMG63werechosenusingtheRPMI1640mediumwith10℅fetalbovineserum（FBS）.Then,theculturedMG63cellswereexposedtoBMP2,nogginandIGF-Iatdifferentconcentrationswithzeroconcentrationascontrolgroup（CON）.AbilityoftheproliferationofMG63cellswasdetectedbymethylthiazolyltetrazoliummethod（MTT）.theconcentrationofBALPandOCofosteoblastsweredeterminedbyELISAmethod.atdifferenttimepoints（12h,24h,48h,72h）afteroptimaldosageofnogginBMP2,IGF-Iwereaddedintotheculturemedium.AndtheexpressionlevelofBALPandOCwereinvestigatedbyreversetranscriptionPCRatthesametime.
Results:
1.TheproliferationabilityofMG63cellstreatedwithBMP2,nogginandIGF-IgroupsweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.05）.TheeffectsofthreefactorsonMG63cellwasdose-dependentlyandtime-dependentlyafterculturedfor72h.ThemosteffectivegrowthofMG63cellsshowedat2×10-9mol/LofBMP2withtheproliferationrateof179.59℅and1×10-8mol/LofIGF-1withtherateof189.80℅,while8×10-9mol/Lnogginwiththeinhibitoryproliferationrateof15.51℅,respectively.
2.TheconcentrationofBALPtreatedwithBMP2,nogginandIGF-IgroupsweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.05）for48h,especially,thenoggingroupwasextremelysignificant（P＜0.01）,andtheBALPmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent（P＜0.05）.
3.TheconcentrationofOCtreatedwithnoggingroupsweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.01）for24h,buttheOCmRNAexpressionwerenotsignificantlydifferent（P＞0.05）.TheconcentrationofOCofBMP2groupweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroupsignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.01）,andtheOCmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent（P＜0.05）.TheconcentrationofOCofIGF-IgroupweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroupsignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.01）,andtheOCmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent（P＜0.05）.
Conclusion:
BMP2andIGF-IpromotedtheproliferationofMG63cellswhereasnoggininhibited.Noggin,BMP2,andIGF-IenhancedtheconcentrationofBALPinosteoblasts.BMP2andIGF-IimprovedtheconcentrationofOCinosteoblasts,whereasnoggininhibited.
Keywords:
Noggin;bonemorphogeneticprotein2（BMP2）;insulin-likegrowthfactorI（IGF-I）;MG63cell;proliferation;differentiation.
前言
生长是动物个体发育特有的生理特点，其主要表现在体高体长的增长方面。
而体高体长的增长则源于骨骼的纵向生长，从而形成相应的骨骼系统，达到体高体长的增长的目的。
骨骼系统也是机体非常重要的一个组成部分，它支撑躯体，保护内脏，并且和骨骼肌一起协调配合完成其运动功能。
在骨骼的生长发育过程中，骨组织不断进行着新骨形成和旧骨吸收的骨重建过程，即骨形成（boneformation）与骨吸收（boneresorption）的动态平衡代谢过程。
骨形成由成骨细胞介导来完成。
在骨形成过程中，成骨细胞主要经历细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和细胞凋亡四个阶段。
在幼年生长时期，骨形成远远大于骨吸收（KrupaBetal,2005），为骨骼的生长提供了良好的基础，也为体高体长的增长提供了重要的保证。
在成年时期，骨的形成较为稳定，骨骼的生长不再发生变化，这主要是受到骨形成与骨吸收相对均衡的一个动态调节作用来完成。
在晚年时期，则主要趋向于骨吸收大于骨形成，从而骨形成会受到一定的影响，这将导致一系列骨疾病的发生，比如在老年人群体中常出现的骨质疏松症。
然而骨骼的纵向生长是一种十分复杂的过程，是多种内分泌激素、生长因子在时空上对生长板综合作用的结果。
内分泌系统的全身性激素如生长激素、降钙素、甲状旁腺激素、性激素、糖皮质激素等，与生长因子如胰岛素样生长因子-（Iinsulin-likegrowthfactor-I，IGF-I）、骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMPs）、转化生长因子（transforminggrowthfactorTGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactors，FGF）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、甲状旁腺素相关肽（PTH-relatedpeptide，PTHrP）等局部因子，以及外源性物质如维生素D等相结合，共同调节骨骼生长过程。
1.BMP蛋白（一级标题）
1.1BMP结构和功能（二级标题）
在1965年，Urist首次发现骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP），BMP属于转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β）超家族的一员，具有诱导骨形成的作用，现已发现其家族至少有20多个成员。
BMP是一种低分子量酸性多肽，属于二硫健交联的生长和分化因子（WozneyJM等，1998）。
是结构类似的高度保守的功能蛋白质族，其C-端有一个高度保守的结构域，内含7个位置稳定的半肤氨酸，这对于形成正确的二聚体结构有重要意义。
研究发现，BMP的活性形式为二聚体，它既可以两个相同的链形成的同源二聚体起作用，也可以两个不同的链形成的异源二聚体起作用。
BMP合成时是一个大的前体蛋白，包括一个信号肤部分，一个前结构域及一个羧基末端区。
当羧基末端区经蛋白水解酶作用从前体蛋白上释放出来时，二聚体即开始形成，它释放到细胞外与机体各处靶细胞表面的相应受体结合而发挥作用。
BMP家族成员都通过结合两种丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜受体（即BMPⅠ型和Ⅱ型受体）发挥其生物学活性功能（MiyazonoKetal,2001）。
研究发现，BMP之间可与不同的受体结合，表现信号传递的多样性。
正是同一种BMP可结合几种不同的Ⅰ型受体，所以才表现出具有调节细胞趋化、增生、分化、迁移和凋亡等多种功能（MehlerMFetal,1997）。
例如，BMP与合适的受体结合，能够在体内、体外诱导未分化的间充质细胞向软骨、骨细胞发生不可逆的分化，形成软骨和骨组织（BarbozaEetal,1999）。
1.2BMP诱导成骨机制（二级标题）
BMPs是由多组单位构成的复合物。
据研究报道，能够对成骨前体细胞MSCs的成骨分化作用主要有BMP2、6、9三种BMP蛋白，而其它的BMP则对成熟的成骨细胞的有作用，其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子（WozneyJMetal,1998）。
研究发现BMP作为一种强骨诱导活性的生长因子，能够启动MSCs的成骨过程（WuXetal,1996）。
BMP对MSCs分化促进作用，主要是增加细胞内BALP活性，提高胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥素的表达。
这可能是因为MSCs中有较多的未分化细胞，BMP与该细胞膜表面特异的膜受体结合，通过信号转导途径，激活细胞相应基因表达促进成骨作用的蛋白。
Gazze研究发现BMP降低细胞内的胶原酶mRNA的表达，利于细胞外基质的合成（GazzerroEetal,1999）。
跨膜丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶是BMP的受体，BMP的诱导机制控制着成骨过程的趋化、有丝分裂及分化三个关键步骤（ReddiAHetal,1995）。
骨诱导是指一种组织或其产物能使第二种组织分化成骨的过程。
诱导成骨需具备三个条件（StoneCA等，1997；ReddiAH等，2000）：
（l）存在诱导因子，当某些部位BMP浓度达到一定程度，就可以诱导骨生成。
（2）存在BMP的靶细胞群，即骨髓中存在诱导性成骨细胞（IOPC）和定向性成骨细胞（DOPC）（ReddiAHetal,1995），前者需要分子信号诱导分化，而后者可以自行分化为成骨细胞。
诱导性成骨细胞是作为BMP靶细胞。
体外研究表明BMP靶细胞还有：
结缔组织中未分化而有活力的间充质细胞、骨膜基质细胞、骨膜细胞（BostromMPetal,1993；BoschPetal,2000）。
（3）存在允许骨生长的正常环境。
BMP诱导成骨包含有3阶段，每一阶段都具有多分子放大效应（ReddiAHetal,2000）：
（1）诱导趋化，是指细胞响应化学信号分子浓度变化所做出的方向性移行，在BMP趋化作用下，血浆纤维连接蛋白与产胶原的骨基质连接，促进间充质细胞黏附其上发生增殖。
天然牛BMP3和BMP4在体外可以直接趋化血中单核细胞（ReddiAHetal,1995）。
趋化性与BMP浓度及细胞上的受体密度有关；
（2）诱导有丝分裂，细胞通过有丝分裂得到增殖；（3）诱导分化，BMP可以诱导成纤维型细胞分化为成骨型细胞。
BMP在诱导软骨化骨时伴有I型胶原和II型胶原，碱性磷酸酶基因表达。
2.Noggin基因的概况（一级标题）
2.1Noggin基因的结构（二级标题）
2.1.1Noggin基因的结构特征（三级标题）
在1992年，California大学的Harland，R.M.和Smith，W.C.从非洲爪蟾的胚胎中分离出noggin基因，在人的体内定位于染色体17q22，在大鼠与小鼠体内定位于11号染色体。
NoggincDNA编码产物为26kD的蛋白，具有疏水氨基末端，是一种分泌蛋白。
Noggin基因编码的蛋白序列具有高度的保守性，人类noggin的氨基酸序列与爪蟾、小鼠、大鼠、兔子、马具有高度的同源性。
它对胚胎和个体发育有着重要的作用，如神经管的形成和关节软骨的形成。
结果
实验采用MTT法主要基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解，产生紫兰色结晶状颗粒，其量与活细胞数呈正比，也与细胞的活力呈正比，因此本文应用MTT法测定MG63细胞增殖活性的变化。
运用外源BMP2蛋白干预MG63细胞的增殖，结果显示，BMP2蛋白能够直接促进MG63细胞的增殖，呈表现出剂量和时间依赖性，浓度为2×10-9mol/L作用72h时增殖率最高，为179.59℅。
与本文的研究结果不同，其他学者的研究结果（KuoPLetal,2006）显示，100ng/ml的BMP2作用48h对MG63细胞没有增殖作用，显然本文使用的有效浓度更低。
在体外，外源BMP2直接刺激成骨细胞的形成和成熟，是成骨细胞增殖、分化和形成的有效促进物。
研究证实（王军琳等，2004），外源BMP2蛋白能够显著诱导周期蛋白CDK4表达的增加，促进细胞的增殖。
因为细胞周期蛋白D在细胞G1期进程中控制着G1期的时间，CDK4（或CDK6）作为催化亚基与其结合形成复合物构成全酶发挥作用，促使细胞越过限制点，完成G1期向S期时相的转换。
成纤维细胞中cyclinD1过度表达导致G1期缩短，提前进入S期，细胞体积小并丧失对外源性增殖分裂信号的响应。
CyclinD1和CDK4在肿瘤细胞的细胞周期循环中出现障碍时，CyclinD1表达产物的堆积将使肿瘤细胞的G1期缩短，引起细胞的过度增殖（SherrCJ，1996）。
外源性noggin蛋白对MG63细胞的增殖具有明显的抑制作用，并存在明显的时间和浓度依赖性，浓度为8×10-9mol/L作用72h时对MG63细胞增殖的抑制率达到15.51℅。
应用浓度为1μg/ml时noggin（康健等，2009），对MG63细胞的抑制率为15.30%，相比之下，本文应用的noggin有效浓度更低，之间的差异可能与胎牛血清中的干扰因子有关。
在培养基中添加胎牛血清的同时也将其中的BMPs等因子带入（马忠仁等，2003；李巍等，2003），可能会对noggin蛋白的作用造成一定的干扰。
noggin对细胞增殖的抑制作用，主要通过抑制BMPs实现的。
Noggin是BMPs的特异性拮抗剂，可与BMPs结合形成较大的戒指样结构，遮蔽了BMPs上的受体结合位点，从而抑制BMPs与其受体结合（ZehentnerBKetal,2002）。
在动物骨的形成过程中，noggin主要拮抗BMP2的作用，本文的研究结果也显示，BMP2对成骨细胞的增殖起直接的促进作用，本文在加入noggin因子之前，以无血清的牛血清白蛋白代替胎牛血清对MG63细胞进行饥饿培养，消除了胎牛血清带入BMPs等干扰因子的影响。
本文的研究结果显示，外源IGF-I蛋白对MG63细胞增殖有直接的促进作用，且存在浓度和时间依赖性。
IGF-I在1×10-8mol/L作用72h时的增值率最高，为189.80℅，与已知结果基本一致（LangdahlBLetal,1998）,IGF-I刺激成骨细胞的DNA和RNA的合成，促进细胞的生长、增殖及分化，以自分泌和旁分泌的形式调节骨骼细胞的功能，影响骨的形成，并抑制小鼠成骨细胞的凋亡（HillPAetal,1997）。
与相同浓度的BMP2相比，IGF-I的作用较强，提示成骨细胞的增殖主要受IGF-I的调节。
骨骼纵向生长过程是以生长板为中心的骨形成与骨吸收的动态平衡过程。
在机体的生长发育过程中，骨形成大于骨吸收，因此新骨不断形成，骨干加长，从而实现骨骼的纵向生长。
成骨细胞介导骨的形成。
骨碱性磷酸酶（BALP）和骨钙蛋白（OC）是成骨细胞在不同分化阶段的代谢产物。
骨组织形成经过两个步骤，首先是形成类骨质（osteoid），然后类骨质矿化（mineralization）为骨组织。
成骨细胞分泌骨基质的多种有机成分，包括骨碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、蛋白多糖、骨钙蛋白等构成类骨质。
胶原蛋白与粘多糖构建骨盐沉积的支架。
成骨细胞向类骨质中释放富含碱性磷酸酶和钙结合蛋白的基质小泡。
在碱性磷酸酶作用下，类骨质矿化成为骨基质。
类骨质矿化是无机盐有次序地沉积于类骨质的过程，其中最关键的是无定形的磷酸钙形成羟基磷酸灰石结晶。
钙离子和磷离子是矿化的基本物质，钙离子和磷离子形成羟基磷酸灰石结晶。
骨钙蛋白（OC）具有钙离子结合位点，通过骨钙蛋白的
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