TSWV的抢帽机制单碱基互补和引物长度的需求.docx
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TSWV的抢帽机制单碱基互补和引物长度的需求
在体内TSWV的帽替换机制：
单碱基互补和引物长度的要求
蕃茄斑萎病毒（TSWV）转录起始过程中使用的封端前导序列的要求进行了测试使用突变苜蓿花叶病毒（AMV）的RNA作为特异帽替换者在转基因烟草（Nicotianatabacum）的植物表达的AMV复制酶蛋白。
使用AMVRNA3一系列突变体，即：
在5'-非翻译区或在亚基因组RNA4前导序列，序列分析表明，裂解的前导序列的长度可能会有所不同，在13和18个核苷酸之间。
卵裂发生优先的A残基，表明为一个单一的互补碱基与TSWVRNA为模板，可以确认使用由宿主体内的mRNA帽替换分析的需要。
关键词：
抢帽、负链RNA病毒、转录起始、TSWV
分段的，负链RNA病毒的转录起始机制通常称为`帽替换'。
在此过程中，一个7m-G顶端的宿主的mRNA被招募通过病毒转录酶复合物，随后由病毒编码的核酸内切酶进行切割。
将得到的顶端的前导RNA用于最初转录病毒的基因组上，作为最广泛地描述在流感A病毒
但是，对于序列特异性识别的要求，合适的宿主RNA的长度和结构的要求仍然相当有限。
通常，帽替换的RNA裂解从帽结构第15个核苷酸的距离开始，虽然在10和20个核苷酸之间的长度发生变化。
例外情况已报告的颗粒（Tacaribe病毒）和Nairovirus属（Dugbe病毒）的成员，使用时间相对较短（分别为：
1±4和5±16个核苷酸）。
非病毒前导序列。
对于许多这些病毒而言，其mRNA的序列分析显示在3'端的非病毒序列的碱基偏好，假定通过病毒的核酸内切酶切割的偏好序列的反应。
例如，Dugbe病毒情况下，信使核糖核酸已被提出在C残基处专门取代，而Bunyamwera病毒用于切割后的U残基已经提出了强烈的偏好（80％研究的mRNA）。
然而，大多数mRNAs基因分析，在这种情况下产生在体内，因此特定基因mRNAs被用来提供这些前导序列（帽者）仍然下落不明。
因此，它仍然是未知的帽替换裂解是否已经确实立即发生后假定3'端的顶端的前导序列，或这个裂解是否已更远的下游侧发生，例如，一个或两个核苷酸，这将是病毒模板的互补3'末端残基。
对于多种病毒，体外研究已经提供了有关前导序列的长度要求的信息这就表明碱基对相互作用可以促进帽前导RNA序列与病毒模板RNA对齐。
汉坦病毒，一个额外的‘引物和重新调整’的机制已被提出来解释从转录起始研究获得的数据。
在‘引物和重新调整’的机制期间，转录起始于顶端的前导RNA，病毒的模板RNA碱基配对，并起始延长仅几个核苷酸。
随后，它从病毒RNA模板释放，重新调整凭借病毒的末端重复序列进行反馈。
只有这样，新生的mRNA链的逐步延伸的发生。
一个‘引物和重新调整’的机制的原因目前还不清楚，但是，它建议在病毒RNA聚合酶启动汉坦（抗性）基因组和mRNA的合成与GTP。
同时，发生的`引物和重新调整的机制已经提出了几个其他的负链RNA病毒，例如杰米斯顿病毒和君越病毒，为了解释病毒mRNA的5'端内重复的异构序列的存在。
番茄斑萎病毒（TSWV）为典型的番茄斑萎病毒属属布尼亚病毒科，负链RNA病毒三方基因组成员之一。
首先TSWV帽替换发生已被调查的植物病毒。
这些研究表明非病毒前导序列，12-21个核苷酸长度的存在下，在病毒的亚基因组mRNA的5'末端。
最近的研究结果表明，在烟草（Nicotianabenthamiana）与TSWV和苜蓿花叶病毒（AMV）的共同感染病毒，所有后随链（正链RNA）病毒的顶端的（子）的基因组RNA可以在体内作为TSWV上帽替换者，同样显示出玉米条纹tenuivirus中与大麦的条纹花叶hordeivirus（埃斯塔布鲁克等人，1998）发生共同感染。
AMV前导序列的分裂优先发生在一个A的残留物。
AMV顶端的前导序列被发现在5'端TSWV的N和NSs的mRNA的长度变化，即使当源自相同AMV的RNA分子，除RNA3，显然是一个单一的切割位点被使用。
显然，AMV的RNA3帽的前导序列符合严格的要求，导致在一个独特的裂解位点。
然而，原始AMV的RNA3序列对准，以及那些RNA1，2和4组，与嵌合体AMV±TSWVmRNA序列不能识别裂解位点，这个位点的位置是依赖与前导序列和模板RNA之间可能的互补性。
为了测试前导序列裂解指定长度的偏好，裂解特异性和可能的碱基配对要求，对突变AMV的RNAs进行分析它们作为一个在体内的系统上可操作的替换者的能力，。
为此，转基因烟草植物（P12）表达的AMVp1和p2复制酶亚基的使用，允许在体内复制的AMVRNA3分子在他们的前导序列的特定突变。
这里，它被显示出作为帽者可以测试TSWV转录起始过程中，设置在这样的突变AMV的RNA。
这些分析的补充是通过检测宿主基因mRNAs帽捐助者而完成的。
总之，在体内的观测表明，对于成功的转录起始，需要截去前导序列和病毒模板RNA之间的单个碱基之间的互补。
结果
使用突变的AMVRNA3前导序列的转录起始TSWV
从以往的研究中，这众所周知的所有四个AMV的RNAs被接受为TSWV转录起始的的AMV前导序列的裂解优先发生在A残留物。
这些结果是在支持可能的替换前导序列和模板RNA之间的碱基配对要求，但仍留有另一种解释的空间（图1）。
为了收集进一步的证据，优化在A残基裂解确实反应碱基配对的要求，进行两组实验。
首先，它的影响的长度是否替换前导RNA随着可用的A残基的位置严格共同变化。
其次，进行了测试，在前导序列优选的切割位点的G替换A残基作为帽者是否将被接受，但现在TSWV的RNA模板倒数第二个残基（C）的碱基配对。
为此，具体的AMVRNA3前导突变体呈现TSWV症状，使用转基因烟草植物（P12）表达有功能的AMV的p1和p2复制酶亚基。
正如之前报道，这种植物支持复制和AMV的RNA3的全身扩散，甚至提供如花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动的cDNA克隆。
第一个AMVRNA3的野生型结构被共接种于TSWV，7天后嵌合AMV±TSWV的mRNAs基因采用RT±聚合酶链反应被从全身感染的的顶部叶片中提取出来（图2A）。
分析表明，P12植物中积累的AMVRNA3分子确实使用为TSWV的mRNA合成（图3A，车道WT）的帽捐助者。
几个独立的克隆的序列分析（表Ⅰ）表明，发现AMV的RNA3前导序列和TSWV的mRNA序列之间的交界位点序列数据完全匹配，从早期的实验期间，共同N.benthamiana植株接种TSWV和AMV。
作为下一个步骤，以调查裂解是否将特异发生在A残基，单点突变体（表Ⅰ）在核苷酸17或18位置发生，并随后用于与TSWV上P12植物共接种实验。
人们预期在17位点处A碱基换为C碱基，这个变化将导致产生在一个-1移位的切割位点，将导致AMV的TSWV的mRNA内前导序列变成为一个更短的核苷酸序列。
同样地，在18位点处一个A变化成C会导致一个+1移位仍然满足所谓的裂解特异性核酸内切的切割位点的A残基。
在这种情况下，添加的AMV前导序列的TSWVmRNA表达增加的大小由一个核苷酸，，在其中裂解将发生区域处的核苷酸19处的A残基，。
独立的RT±PCR克隆的序列数据（图3A，表Ⅰ），收集这些AMVRNA3突变体和TSWV共同接种在P12的植物，当17位的C被改变成A，和18位的A被改变成一个C而实际表现出的±1变化。
因此，前导序列的长度移随着可用的A残基的位置，这表明裂解特异性（在A）确定前导长度和支持的模型，在该模型中，一个单一的前导和模板之间的互补碱基RNA是必需的。
（图1）
为了证明得出结论说，参与碱基配对，进行了两个点突变G残基介绍（C17G和A18G突变，表I），这将可能导致裂解TSWV模板的G和基础配对的倒数第二个核苷酸（C）。
AMV的RNA后代的克隆和序列分析表明，这些突变迅速转化为突变体A18C。
最终结果，RT-PCR克隆得到来自共同接种这些AMVRNA3突变体与TSWV总是显示为AMV前导序列与突变体A18C（表Ⅰ），所观察到的相同的核酸内切酶切图谱。
此外，额外的AMVRNA3突变体测试，即C17U和A18U，迅速转换成突变A18C（表Ⅰ），表明在RNA3的AMV前导序列的可变性的限制。
诱发TSWV转录突变AMVRNA4前导序列确认替换者的顺序和长度的要求
其前导序列的进一步突变导致AMVRNA3遗传不稳定性，接下来我们提出了修改AMVRNA4前导序列TSWV感染的P12植物，确认裂解特异性的残基的测试前导长度的偏好和碱基配对的要求。
AMVRNA4在几个体外研究中已被用来作为前导供体和在体内TSWV的其它负链RNA病毒。
AMVRNA4是一个亚基因组mRNA（图2B），其前导序列位于基因组RNA3和内部不包含任何顺复制信号。
因此，RNA4的前导突变体可能会比RNA3的前导突变体更稳定。
野生型AMVRNA4只包含在富含U残基的13和14位的两个A残基（表二）。
因此，仅将需要的一个最小的修饰，以获得一组在不同的位置A残基的突变体在寡聚（U）的拉伸从位置12至18内运行（表Ⅱ中，突变体表示为A12-A18）。
此外，突变体缺少任何A残基（突变型RNA4-NOA）12位和18位之间。
这些突变体让我们来测试是否掠去前导序列的长度将联合各不相同，正是在这个前导序列A残基的位置，并提供有关的前导长度偏好的信息。
首先，对健身和AMVRNA4突变体的遗传稳定性进行了测试，接种携带这些突变的P12植物和后代RNA4序列分析的cDNA的建构。
所有的突变是相对稳定的，除了RNA4NoA和A12。
从突变RNA4-NOA的子代RNA无法通过RT-PCR回收，没有外壳蛋白产物的发现，表明该突变是不可行的（数据未示出）。
RT±PCR和几个独立的克隆序列分析表明，突变A12是不稳定的，它可迅速转化为野生型的RNA4以及其他的突变序列（A15-A17）。
对于大部分的其它突变体，在P12植物（表Ⅱ）中复制单轮后，少量除了预期的突变基因型的另一突变序列被发现。
经测试AMVRNA4突变体的适用性和稳定性，提供了帽捐助者，在共同感染TSWV于P12植物。
RT-PCR克隆得到的TSWV的Ň的mRNA从这些共感染实验（图3B）和随后的5'-端的前导序列的序列分析的获得表明，所有的RNA4的A残基的突变体，在不同的位置中的AMVRNA前导可以作为帽捐助者（表二）。
TSWV的Ň的mRNA，从共同接种实验获得与AMVRNA4的突变体，从几个克隆的序列数据表明随着前导范围内寡聚（U）A残基的位置的替换而改变前导序列的长度。
一个数的AMVRNA4突变产生了多形态群体的RNA4分子（表二），不同大小顶端的前导序列在TSWV基因产生的反应的这种变化中被发现。
尽管这种变化，前导序列的长度总是随着A残基的位置而发生转移。
虽然数字差异无统计学意义，从不同RNA4分子P12的扩增后得到的子代的序列结果指向一个偏好的分子中含有A残基位置+16（表二），当使用宿主的mRNA作为帽捐助是，它被发现。
RNA3和RNA4的在两个AMV的残基的位置与前导序列的长度表示严格的共变性，核酸内切裂解的前导发生A残基的3'端，以便与TSWV模板RNA的第一U残基的碱基配对。
然而，作为替代，其结果可以解释由切割帽替换RNA的5'端的A残基（图1B）的核酸内切酶活性，与TSWVmRNA的A残基中的第一个核苷酸结合期间范围内转录过程的封端的引物伸长。
这种情况似乎不太可能在使用野生型的AMVRNA4的RNA的前导作为一个帽供体，来获得序列数据分析。
这包含两个A残基（位置A13和14），来自的RNA4的TSWV基因前导序列显示，残基A13优先保留，它不适合切割机制这意味着没有招募前导序列的3'-末端A残基。
对A13-A18突变体的结果表明RNA4前导序列在一定程度上被修饰，而P12植物体内RNA3或RNA4扩增没有完全丧失。
因此，要证实帽替换过程中的领导者前导序列和TSWV模板之间的一个单碱基配对的要求，AMVRNA4突变体的G15被实验。
这种突变没有任何A残基，并含有单个的G在寡聚（U）长（表二）的第15位内。
对用G15前导序列的TSWVmRNA的引物的使用，只有一个低的RT-PCR检测信号被获得（图4A），但得到的单克隆作为缺乏TSWV模板的5'端A残基支持碱基配对的mRNA序列的模型。
这只可能发生裂解突变RNA4前导3'残基G15和TSWV模板（图4B）的倒数第二个C的碱基配对。
帽抢在宿主mRNA的识别
TSWVmRNA的引物与AMVRNA4突变G15（图4A）的回收率低，可能是由于倒数第二个残基的起动效率下降和该突变体在P12植物的复制减少。
为了规避第二种的并发症，我们通过宿主mRNA的前导序列使用TSWV的转录起始来扩展我们的体内研究。
选择的来自GenBank数据库中两个不同的宿主（Nicotianatabacum）基因的转录起始位点被明确的确认（表III）：
（多聚泛素;ubi.U4;DDBJ/EMBL/GenBank登记号X77456）第一个基因可预测的切割位点在17位点的单一A残基和其他（Sadenosylmethionine的脱羧酶;SAMDC;DDBJ/EMBL/GenBank登录SION号AF033100）潜在的一个更复杂的图像，其mRNA在位置12和21之间包含多个潜在的切割位点（表Ⅲ）。
使用特定的前导的多聚泛素基因的RT-PCR引物，确实可以得到嵌合TSWV基因的TSWV感染烟草植株的总RNA（图5）。
几个克隆的序列分析表明，ubi.U4mRNA在17残基位点被特异性切割（表Ⅲ），证实所获得的结果在AMV前导序列。
SAM-DC的mRNA也似乎是在一个单一的位点出现，但现在经过切割的首选位于核苷位点16的G残基。
所有的mRNA含有SAM-DC前导序列缺乏末端正确的TSWV序列（表III）的A残基，而只能被解释为这样的结果可以G16和随后的下游信使核糖核酸病毒模板的倒数第二个的C残基的碱基配对。
因此，使用SAM-DC前导序列表示TSWV的帽抢机制的可塑性，位置比核苷酸序列同源性显得更为重要，只要替换病毒模板前导序列的3'末端核苷酸碱基对的最后或倒数第二的残基。
从AMV（Duijzings等，1999）的共感染的研究，获得的数据使用突变的AMV的RNA3及RNA4提供者，和两个宿主的mRNA，可以得出结论，TSWV换帽，前导序列帽后面的A残基的优先裂解，此外，应该优先发生在或接近帽16位置。
据现在了解的单碱基互补的前提条件是接受前导序列的mRNA帽供体，克隆TSWV基因的宿主来源的前导序列（面包车Poelwijk等人，1996年以前获得的序列数据），可以用来验证我们的结论。
在所得的序列的80％，来自宿主的前导序列适合的一个机制，使裂解的A残基后，在13-21个核苷酸（平均长度为16个核苷酸）距离发生。
对于其他的20％，前导序列适合切割G残基后（距离帽的14-22个核苷酸，平均长度为17个核苷酸的），在倒数第二的C残基的TSWV模板处，还发现通过碱基配对使得起动替代AMV前导序列。
讨论
帽抢掠，不同的片段负链RNA病毒的转录起始作为一般机制，在体内和体外的方法已被研究。
虽然在这些实验中获得的数据的一些建议，供体RNA和病毒模板之间的互补性或碱基配对可能需要，以及该视图与数据的不同一性，但是，无论是在体内和体外的方法用于研究帽抢的过程中都有一些缺点。
在体内的方法，主要是根据分析含有宿主衍生的序列，通过5'RACE扩增获得，这意味着它几乎是不可能的，以确定在其转录起始序列使用之前的一个给定的帽供体RNA。
因此，帽供体和确切的核酸内切裂解位点的一个特定的序列的影响仍然是未知的，也没有任何相同的帽供体替代切割位点被识别。
另一方面，在体外方法，允许可能的帽供体的精确功能中的帽抢机制的供给提供的可能性，但在这种所有体内的情况条件下可能没有反应。
本研究中中所描述的方法与自然优势结合起来，在体内条件与已知和甚至可变前导序列的使用。
，具体突变体的AMV前导序列可以很容易生成和机械接种，无论是作为DNA结构或体外转录转基因（'P12'）植物，成为通过植物放大的AMVp1和p2病毒高水平复制的蛋白质。
在此之后的两个帽供体选定宿主的mRNA基因在体内分析相结合，在体内的方法，我们可以证明，一个单碱基互补的顶端首要的成功的前导RNA病毒模板的要求。
此碱基配对应优先在供体RNA的16位发生，尽管在核苷酸13和18之间的所有的位置可以使用不同的效率（图3B）。
此外，这种碱基配对不仅可以与3'末端的A残基的病毒模板（显然是最优化的情况下）之间发生，也可以与倒数第二个G和甚至倒数第三A残基之间进行配对，AMV的RNA4中A16前导序列mRNA的引物被观测，这缺乏正确的TSWV序列（表Ⅱ）的前两个核苷酸。
评估从较早的研究中宿主前导序列引物TSWVmRNA的表达的序列时，用于切割的偏好在第16位与3'病毒模板末端的残基，以及一个可能的前导序列3'的倒数第二个残基的使用所观察到得启动效应。
对病毒的模板调整招募的封端的RNA引物的证据，导致重复插入病毒的基因组序列的前导序列（正品）病毒的RNA序列之间的前几个核苷酸，此证据在我们的研究中几乎被监控。
只有一种情况（表二;AMV4A15）是一个额外的AG核苷酸插入已被发现。
这样的重复序列更频繁地与一些动物感染病毒，以及与植物的感染隶属柔丝病毒被发现。
插入的序列汉坦病毒作为一个‘引物和重新调整’的机制的结果已首先被解释。
插入病毒序列的5'端前导序列和病毒序列之间的低频率表明，为TSWV的起始转录发生在3'最终端A残基，而不是在倒数第三个A残基。
因此，作为转录起始的一种手段，引物和重新调整的机制似乎并没有受到青睐。
未来的实验可能会揭示，在TSWV的mRNA的5'末端核苷酸重复是很少见的。
虽然5'端前导序列内的特定的核苷酸碱基配对的残基的组成和距离在作为帽供体的使用效率方面发挥重要作用，前导序列内的特定的二级和三级结构的影响还没有被研究。
如果二级和三级结构的确在5'端的前导序列内的帽抢掠的过程期间发生，它们可能会影响帽结构和可能的切割位点之间的物理距离，从而改变核酸内切酶裂解的最佳位点。
但是，这可能是病毒聚合酶复合体破坏了这些5'端的前导序列内的二级和三级结构。
病毒核蛋白，单链RNA结合蛋白（Richmond等人，1998），是病毒转录酶复合物的一部分，它可能在此发挥的作用。
总之，组合突变体AMVRNAs和宿主的mRNA分析中造成TSWV转录起始期间帽抢者的长度和特定的核苷酸组成物的需求的见解被提高。
此外，它解决了帽抢过程中，可能适用于所有节段负链RNA病毒的碱基配对要求。
材料和方法
寄主植物
转基因烟草NN植物表达的AMV复制酶蛋白P1和P2（简称为P12的植物），用于在野生型和突变型的AMVRNA3和RNA4体内如前所述从克隆的cDNA复制（尼尔曼等人，1993）。
窗体顶端
质粒的构建
质粒pCa32T，含有野生型的AMVRNA3侧翼由CaMV35S启动子和胭脂碱合酶（NOS）终止（尼尔曼等人，1991）的cDNA拷贝，用作建立突变体RNA3和RNA4AMV的来源。
突变体的AMVRNA3的结构，包含在AMVRNA3序列的17或18的任一个位点突变作了扩增pCa32T使用的引物α35S（ctctccaaatgaaatgaacttcc，互补的35S启动子）和A3/D17（gtattaataccattttDaaaatattccaattc，核苷酸1-32相同的AMV3RNA序列，D=A，G或T）或A3/B18（gtattaataccattt-tcBaaatattccaaTTC，B=C，G或T）和延长模板PCR系统（Roche公司）。
使用高纯度的PCR产物纯化试剂盒（Roche），对扩增得到的PCR片段进行纯化，用限制性内切酶DpnI消化（破坏输入模板DNA），并利用T4DNA连接酶（Promega）连接。
单个克隆的序列分析被验证。
点突变体的AMVRNA3在核苷酸17位点被称为C17A（从野生型的C残基被改变的核苷酸17到一个A残基），C17G及C17U。
AMVRNA3在核苷酸18位点突变被称为A18C（在核苷酸18位处碱基突变为C残基），A18G和A18U。
同样的，在基因组启动子区域的AMVRNA4点突变均来自pCa32T使用引物A4/rev（aaaataaaaacggcccattaccg，互补到AMVRNA3序列核苷酸位置1250-1272年），A4/A12-A4/A18（Attttttctttcaaatacttccatcatgag;TAtttttctttcaaatacttccatcatgag的;TTAttttct-ttcaaatacttccatcatgag;TTTAtttctttcaaatacttccatcatgag;。
TTTTAttctttcaaa-tacttccatcatgag;TTTTTAtctttcaaatacttccatcatgag;TTTTTTActttcaaa-tacttccatcatgag），A4/noA（Tttttttctttcaaatacttccatcatgag）A4/G15（TTTGtttctttcaaatacttccatcatgag）（所有相同的野生型RNA3序列核苷酸位置1273-1302）。
AMVRNA4的点突变体被称为A12（含有野生型RNA4序列的12位点的A残基和在13和14位的核苷酸U残基的核苷酸12的），A13，A14，A15，A16，A17，A18和G15（表Ⅱ）。
同样，突变RNA4-NOA，野生型RNA4序列的12和18位核苷酸之间含有的寡聚（U）。
接种P12植物
表达AMV复制酶蛋白P1和P2的转基因烟草NN植物在温室条件下生长（P12的植物），并如前所述进行机械接种35S-cDNA结构及TSWV菌株BR-01。
对AMV-TSWVmRNA的序列分析
TSWVN的mRNA含有封端的5'核苷酸序列来自AMVRNA3和RNA4进行检测，并克隆到pGEM-T载体中，如前面所述。
简言之，从Gurr和麦克弗森所描述的系统侵染的叶片材料中分离总RNA。
从这个总RNA合成第一链cDNA，随后对合成的第一链cDNA使用相同的AMVRNA前导序列的前11个核苷酸的引物的一个嵌套进行PCR扩增。
获得的PCR产物，使用高纯度的PCR纯化试剂盒纯化，并克隆到pGEM-T中，根据制造商的说明。
使用Sanger双脱氧方法所得的克隆进行序列分析。
窗体顶端
宿主前导序列TSWV的mRNA序列分析
TSWV的N的mRNA包含顶端的5'前导序列来自不同的宿主（烟草）基因进行检测，嵌套式RT-PCR和由上述序列测定分析。
简言之第一链cDNA的扩增材料用一个嵌套TSWV引物组合不同的宿主基因的5'末端的第11个核苷酸的特定的引物的进行扩增。
宿主基因的选择是一个多聚泛素基因，与相应的引物UbiU4-1（CCCGGA-TCCATCCTTTGATT）和SAM-DC基因的相应的引物SAM-DC-1（CCCGGATCCATGGAGTCGAA）。
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