杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法编制说明.docx
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杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法编制说明
国家标准《杨树枯萎病菌检疫鉴定方法》编制说明
一、目的和意义：
1目的：
建立杨树等树种传带的杨树枯萎病菌的检疫鉴定方法，为检疫杨树枯萎病菌建立标准和依据，有助于加强口岸对杨树枯萎病菌的寄主植物检验检疫，杜绝杨树枯萎病菌通过口岸传入我国，避免其在我国境内扩散，对我国杨树等树种产生重大经济为害。
2意义：
杨树枯萎病菌属细菌域（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），肠杆菌目（Enterobacteriales），肠杆菌科（Enterobacteriaceae），肠杆菌属（Enterobacter），生癌肠杆菌（Enterobactercancerogenus）。
该病病原菌能为害杨属、桦木属、云杉属等木本植物，引起杨树枯萎病，具有危害严重、较难防治的特点。
生癌肠杆菌是肠杆菌属（Enterobacter）细菌中唯一引起木本植物病害的四种病原菌之一。
据了解到目前为止肠杆菌属已报道了33个种和5个亚种（），与肠杆菌科中能引起人类伤寒的伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi）及能造成作物大量减产的欧文氏菌（Erwinia）相比要少得多。
但是，10多年以来Enterobacterspp.作为一种新的人体条件致病菌及食品安全的潜在危险菌，越来越受到科学界的关注。
然而，肠杆菌属细菌对植物致病性的研究甚少，到目前为止发现的植物上的致病菌只有7个种，包括生癌肠杆菌（E.cancerogenus），超压肠杆菌（E.nimipressuralis），坂崎肠杆菌（E.sakazakii），溶解肠杆菌（E.cloacaesubsp.dissolvens），梨形肠杆菌（E.pyrinus），阴沟肠杆菌（E.cloacae）和桑肠杆菌（E.mori）。
其中四种病原体引起木本植物病害，E.cancerogenus（导致杨树溃疡），Enterobacter mori（导致桑细菌性枯萎病），E.nimipressuralis（导致榆树湿心病），Enterobacter pryrinus（导致亚洲梨褐色叶枯病）。
可见，肠杆菌属中只有生癌肠杆菌能够引起杨树发病。
生癌肠杆菌于1966年被Uroŝević首次报道，并被命名为Erwiniacancerogena。
随后FarmerJJ等于1985年将其改名为Enterobactertaylorae，最终DickeyRS等于1988年将其改名为Enterobactercancerogenus，并一直沿用至今。
该菌一方面经常在临床上被报道，认为是一种人体机会性致病病原；一方面，该菌也能引起一些植物病害，Uroŝević于1966年首次报道该菌能引起杨树溃疡病，在特定条件下能够引起严重的杨树枯萎病症状。
杨树枯萎病产生的病害症状随树木品种的感病性和天气条件而发生变化。
通常情况下该病菌可导致坏死，引起树皮下组织显著生长，伴随着明显的树皮开裂，还可引起云杉等树枝顶端坏死。
侵染后茎周围产生比较宽的开口或封闭的溃疡斑或者数不清的裂缝，从而导致树皮脱落。
感病品种在一定条件下产生的溃疡斑更深并且纵向排列。
可观察树皮、树枝是否有溃疡斑或者开裂现象，树枝顶端是否产生坏死来判断是否发生杨树枯萎病。
杨树枯萎病最早于1966年在捷克斯洛伐克首次报道，现已蔓延扩散到波兰，在一些中年林中引起严重问题。
杨树枯萎病菌的寄主杨属、桦木属、云杉属等树种均是与生态环境和人民经济生活密切相关的树种，病菌一旦从国外传入，由于没有相应的天敌和防治措施，将会大规模扩散，对相关产业造成不可估量的损失。
因此，目前杨树枯萎病菌被列为2007版《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中检疫对象之一。
杨树（Populusspp.）在我国分布广泛、种类繁多，与生态环境和人民经济生活密切相关，也是建立速生丰产林的主要树种。
世界上天然杨树约100多种，而我国约有62种（包括6杂交种）。
我国正处于世界杨树中心分布区区域内，所以我国杨树种类多，分布面积广，遍及22个省（区、市）。
我国杨树林总面积达1000多万hm2（包括3年生以下幼龄树），总蓄积量为42596.5万m3。
全国杨树人工林面积为700多万hm2（包括3年生以下幼龄树），约占我国人工林总面积的19%。
其中用材林面积为309万hm2，约占杨树人工林面积的40%。
杨树人工林分布区，北由北纬49°的松嫩平原北界，南到28°附近的两湖平原，东由沿海岛屿滩涂，西至新疆西部边界，这个分布范围的面积约占我国国土的2/5。
由于杨树品种、类型繁多，分布广泛，生长快，繁殖易，我国集中连片，大面积栽植于用材林、防护林、水土保持林、农田林网和四旁绿化。
但是由于杨树在生长过程中不仅直接受到各类病原物的侵害，各种立地条件和环境因素的影响诱发疾病，而且在栽培过程中品种选择不当，或扩大了适宜栽培的地理范围，或栽培技术措施不力，使得杨树不能健壮生长，有的形成“小老树”，不能抵御各种病原物的侵袭，造成严重危害，引起较大的经济损失。
据相关文献统计，98种（包括品种、无性系、栽培种）杨树上的生物病原物共有246种，其中真菌205种（子囊菌门38种、担子菌门99种、有丝分裂孢子真菌68种）、细菌12种、病毒1种、线虫11种、螨类6种、寄生性种子植物11种。
当然长发病和多见病在我国也仅20种左右。
杨树是一种非常敏感的适地适树树种，每一品种都有它的适生范围，无原则地扩大适宜栽培的地理范围，扩大了某些杨树品种或无性系的优良特性，不顾立地条件盲目引进种植，其结果造成生长不良、诱发多种病害，导致失败。
目前，针对杨树枯萎病菌的快速检疫鉴定还没有相应的国家标准、行业标准或已立项未批准发布的检验检疫行业标准。
国内外针对杨树枯萎病菌的检测没有采用分子生物学方法（如PCR-凝胶电泳、实时荧光PCR等）的检测方法报道。
本标准编写组在查阅大量资料和深入研究的基础上，以国家标准的形式规定了杨树枯萎病菌检疫鉴定方法，建立一种基于病菌在寄主上的症状特点、培养性状、生理生化特征和PCR特异性扩增的杨树枯萎病菌检疫鉴定技术，可以满足口岸对来自杨树枯萎病菌有发生国家和地区的杨属、桦木属、云杉属等的苗木、原木中传带的杨树枯萎病菌的检疫工作需要，为出入境检疫人员准确检疫鉴定该病菌提供科学依据，提高该病菌的检出率，从而保护我国相关产业的发展。
二、标准编制的主要工作过程：
1任务来源:
《杨树枯萎病菌检疫鉴定方法》是国认科函[2010]132号下达的制标任务（计划编号：
20100468-T-469）。
本标准项目由国家标准化管理委员会指定烟台出入境检验检疫局主持起草任务。
本标准起草人耿金培同志由于工作调动原因将本标准交由李金庆同志主持起草。
2标准的主要起草人及承担的工作
李金庆：
烟台出入境检验检疫局，农艺师，硕士，主持标准制定。
厉艳：
山东出入境检验检疫局，高级农艺师，硕士，参加调研与起草工作。
段效辉：
烟台出入境检验检疫局，高级工程师，博士，参加调研与起草工作。
张京宣：
山东出入境检验检疫局，高级农艺师，硕士，参加调研与起草工作。
付海滨：
沈阳出入境检验检疫局，高级农艺师，硕士，参加调研与起草工作。
封立平：
山东出入境检验检疫局，研究员，本科，参加调研与起草工作。
谈珺：
南海出入境检验检疫局，农艺师，硕士，参加调研与起草工作。
管旭芳：
山东出入境检验检疫局，农艺师，本科，参加调研与起草工作。
粟智平：
烟台出入境检验检疫局，高级农艺师，硕士，参加调研与起草工作。
王简：
山东出入境检验检疫局，农艺师，本科，参加调研与起草工作。
刘宁：
烟台出入境检验检疫局，高级工程师，硕士，参加调研与起草工作。
王英超：
山东出入境检验检疫局，高级农艺师，硕士，参加调研与起草工作。
耿金培：
烟台出入境检验检疫局，研究员，本科，参加调研与起草工作。
3标准编制过程
3.1准备阶段：
2014年10月－2015年5月
本标准立项后，起草人首先对GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部分：
标准的结构和编写规则》以及SN/T1345-2010《进出境植物检疫标准编写的基本规定》，进行了系统的研究和学习。
为了科学地制定本标准，起草小组先是收集到了杨树枯萎病菌的标准菌株，随后通过多种方式和渠道收集整理有关杨树枯萎病菌检测方法的相关资料，对杨树枯萎病菌的寄主、地理分布、为害特性、形态学特征、传播规律、各种检疫鉴定的方法最新研究进展等有了全面深入的了解，并开展了相关鉴定技术的研发与验证。
3.2起草、征求意见和审定阶段：
2015年6月－2017年12月
按照GB/T1.1-2009《标准的结构和编写规则》的要求和格式，应用中国标准研究中心开发研制的《标准编写模板》TCS2009软件，进行标准起草，并先后进行了多次修改。
本标准草案和编制说明等材料完成后，在16家检验检疫系统单位和2所高校院所广泛征求意见，发表了48条修改意见（详细结果及修改意见详见征求意见汇总表）。
根据这些单位和专家提出的意见再次进行了认真的修改，从而形成标准草案送审稿。
三、标准的编制依据
1范围
杨树枯萎病菌（Enterobactercancerogenus（Urosevi）DickeyetZumoff）是我国2007年新颁布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中的检疫性有害生物，曾在欧洲波兰、捷克和斯洛伐克造成严重危害。
病菌一旦侵入，由于我国杨树等树种种植范围很广，入侵风险性很大。
本标准规定了进出境植物检疫中杨树枯萎病菌的检疫鉴定方法。
适用于桦木属、杨属、云杉属等木本植物及植物产品等传带的杨树枯萎病菌的检疫和鉴定。
2原理
杨树枯萎病菌（Enterobactercancerogenus），隶属于细菌域（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），肠杆菌目（Enterobacteriales），肠杆菌科（Enterobacteriaceae），肠杆菌属（Enterobacter），生癌肠杆菌（Enterobactercancerogenus）。
主要危害杨树、云杉等木本植物寄主。
根据杨树枯萎病菌在寄主上的症状特点、培养性状、生理生化特征和PCR特异性扩增等特征作为鉴定依据。
3仪器和用具
根据进出境检疫工作的实践和需要而定。
主要包括现场查验所需便携式工具，实验室形态学鉴定所需器具、仪器设备以及分子生物学实验所需要的试剂和仪器。
4鉴定方法
主要是结合现场检疫杨树枯萎病菌在寄主上的症状观察、培养性状、生理生化特性和PCR特异性扩增进行鉴定。
4.1症状观察
仔细观察树皮是否有溃疡斑或者开裂现象，树枝顶端是否产生坏死，茎上是否产生深的程纵向排列的溃疡症状。
该病菌可导致坏死，引起树皮下组织显著生长，伴随着明显的树皮开裂，造成云杉等树枝顶端坏死现象。
侵染后茎周围产生比较宽的开口或封闭的溃疡斑或者数不清的裂缝，从而导致树皮脱落。
感病品种在一定条件下产生的溃疡斑更深并且呈纵向排列。
疑似的病组织要带回实验室进行显微镜检查和病原菌分离。
4.2病原菌的分离纯化
选取产生症状的树枝等病组织，用流水冲洗干净、晾干，剪成小段后用70%的酒精（或1%的次氯酸钠）表面消毒1～2min，用无菌水冲洗3次，晾干后剪碎，于200μL无菌水中浸泡，并用灭菌解剖刀或灭菌玻璃棒破碎组织，尽量使内部细菌释放出来。
15～20min后用接种环蘸取浸液，在营养琼脂培养基（NA）上划线分离，平板在30℃下培养24～48h后，挑取单菌落划线纯化备用。
4.3病原细菌的菌落及菌体形态观察
将纯化的菌株在营养琼脂培养基（NA）上划线培养，观察细菌在营养琼脂培养基（NA）上的生长及菌落形态。
显微镜下观察菌体大小和形态。
4.4生理生化特性测定
取可疑菌株，应用BIOLOGGENⅢ微生物自动鉴定系统或细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行相关生理生化指标测定。
参照谢关林等的方法（2003）取可疑菌株，用Biolog测定生化特征：
在含95种碳源的BiologGN微孔板中，每孔加入150μL所测细菌悬浮液（A值=0.3），在30℃下培养24h后由Biolog读数机测得反应结果，并直接进入Biolog专用细菌鉴定程序。
或者参照Hoffmann等的方法（2005）进行生理生化测定。
4.5鉴定特征
4.5.1病原菌形态及培养性状
杨树枯萎病菌为革兰氏阴性菌，菌体直杆状，两端呈椭圆形，周生鞭毛，能游动，大小0.6µm～1.0µm×1.2µm～3.0µm。
不产生芽孢。
在NA平板培养基30℃培养48h后，单个菌落呈圆形，表面平滑，呈灰白色，不透明，边缘完整。
将纯菌落穿刺接种于NA试管培养基，可沿穿刺线和培养基表面生长良好，偶有气体产生。
图1：
杨树枯萎病菌在NA培养基上的培养特征
4.5.2杨树枯萎病菌生理生化特征
兼性厌氧，接触酶反应阳性，产酸产气，运动，柠檬酸和丙二酸反应阳性，能产生精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶和脱氧核糖核酸酶，Voges-Proskauer反应及明胶液化阳性，不产生赖氨酸脱羧酶、氧化酶、淀粉酶，不能还原硝酸盐，甲基红和吲哚测试阴性。
4.5.3杨树枯萎病菌与肠杆菌属其它植物致病相关种的表型特征区分
可通过生理生化特性鉴定来区分杨树枯萎病菌与肠杆菌属其它能够引起植物病害的相关种。
表1杨树枯萎病菌与肠杆菌属其它植物致病相关种的表型特征区分
Table1PhenotypiccharacteristicsthatdifferentiateEnterobactercancerogenusfrom
otherplantpathogenicrelatedspeciesofthegenusEnterobacter
测试项目
病原菌
杨树枯萎病菌
（生癌肠杆菌）
E.cancerogenus
溶解肠杆菌
E.cloacaesubsp.dissolvens
桑肠杆菌
E.mori
梨形肠杆菌
E.pyrinus
超亚肠杆菌
E.nimipressuralis
阴沟肠杆菌
E.cloacae
阪崎肠杆菌
E.sakazakii
VP实验
Voges-Proskauerreaction
+
+
+
+
+
+
+
MR实验
Methylredtest
-
-
-
-
-
-
-
鸟氨酸脱羧酶
Ornithinedecarboxylase
+
+
+
+
+
+
+
精氨酸双水解酶
Argininedihydrolase
+
+
+
-
-
+
+
移动性
Motility
+
-
+
v
-
+
+
七叶树素水解
Aesculinhydrolysis
+
+
+
+
+
v
+
赖氨酸脱羧酶
Lysinedecarboxylase
-
-
+
+
-
-
-
蔗糖
Sucrose
-
+
+
+
-
+
+
蜜二糖
Melibiose
-
+
+
-
+
+
+
D-阿拉伯糖醇
D-Arabitol
-
-
+
-
-
-
-
D-山梨醇
D-Sorbitol
-
+
+
-
+
+
-
L-岩藻糖
L-Fucose
+
v
v
-
-
-
-
丁二胺
Putrescine
+
+
+
+
-
+
ND
鼠李糖
a-L-Rhamnose
+
+
+
+
+
+
+
柠檬酸盐
Citrate
+
+
+
-
+
+
ND
半乳糖二酸
Mucate
+
+
+
-
+
v
-
α-D-乳酸吡喃糖苷甲酯单水合物
1-O-Methylagalactopyranoside
-
+
v
-
-
+
+
注：
-：
阴性；+：
阳性；v：
疑似；ND:
未获数据。
4.5PCR特异性扩增
4.5.1菌株
杨树枯萎病菌（E.cancerogenus）（来自于美国菌种保藏中心标准菌株ATCC33241），6种肠杆菌属相关病菌桑肠杆菌（E.mori）（来自于浙江大学生物技术研究所），溶解肠杆菌（E.cloacaesubsp.dissolvens）、梨形肠杆菌（E.pyrinus）、超压肠杆菌（E.nimipressuralis）（来自于比利时根特大学国家菌种保藏中心），坂崎肠杆菌（E.sakazakii）、阴沟肠杆菌（E.cloacae）（来自于烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心动植检实验室），7种其它致病菌大黄欧文氏菌（E.rhapontici）、成团泛菌（Pantoeaagglomerans）、丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonassyringaepv.syringae）、伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi）、甲副伤寒沙门氏菌（S.paratyphiA）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）均由烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心动植检实验室保存。
4.5.2DNA提取
采用改良的CTAB法或适用的商品化试剂盒进行DNA提取。
改良的CTAB方法提取DNA方法如下：
（1）用接种环挑取两环新鲜菌苔（NA培养基，30℃培养24h）于灭菌1.5mL离心管中，加入570μLTE缓冲液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0），充分振荡混匀；
（2）依次加入30μL10％的SDS溶液和60μL蛋白酶K，混匀，37℃水浴lh后，再加入100μL5MNaCl和80μLCTAB溶液，充分颠倒混匀，65℃水浴10min；
（3）混液用等体积的酚：
氯仿：
异戊醇（25：
24：
1）混匀，13000g离心1min，取上清液；
（4）加入等体积的氯仿：
异戊醇（24：
1）匀，13000g离心1min，取上清液；
（5）DNA上清液用两倍体积的冰冻乙醇沉淀，再分别用70％酒精洗涤两次，室温干燥，用50μL灭菌超纯水溶解，紫外分光光度仪测定DNA质量并分装保存于-20℃冰箱。
4.5.3PCR引物的确定
4.5.3.116SrDNA基因序列测定
采用改良CTAB法提取菌株基因组DNA，用适合于肠杆菌科序列扩增的细菌16SrDNA通用引物fD2:
5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和rP1:
5’-ACG
GTTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增。
PCR反应体系为25μL：
10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）1μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.2μL，正向引物和反向引物（5mmol/L）各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补足至25μL。
PCR扩增程序为：
94℃2min；94℃45s，57℃45s，72℃2min30个循环；72℃10min。
扩增产物经纯化后，由生物公司测序得到杨树枯萎病菌的16SrDNA基因序列。
杨树枯萎病菌的16SrDNA基因序列如下（1409个碱基）：
CATGCAAGTCGGACGGTAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTCCGGGCCTCACACCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGGTGAGGTTAATAACCTCATCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAACTTGGCAGAGATGCCTTGGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTCCGGGAGGGCGC
4.5.3.2引物设计
依据杨树枯萎病菌与肠杆菌属其它6种近似种16SrDNA序列之间的差异，用PrimerPremier5.0软件设计杨树枯萎病菌PCR特异性引物。
YskwUP：
5’-GCGTTCTTTGTTTGACTGAATGGTG-3’
YskwNP：
5’-ATCGTCGATCTCGCTTGCGGATA-3’
4.5.4引物特异性验证
以杨树枯萎病菌、桑肠杆菌、溶解肠杆菌、梨形肠杆菌、超压肠杆菌、坂崎肠杆菌、阴沟肠杆菌、大黄欧文氏菌、成团泛菌、丁香假单胞菌丁香致病变种、伤寒沙门氏菌、甲副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的基因组DNA及ddH2O为模板，分别用特异性引物YskwUP、YskwNP进行常规PCR反应。
采用25μLPCR反应体系：
PCRPremix12.5μL，ddH2O8.5μL，10μM引物各1μL，DNA模板2
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