酶工程课件考试用.docx
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酶工程课件考试用
酶工程
绪论
1、酶的概念
酶（enzyme）是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。
一、酶工程概念
-------它是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的催化物质。
-------从此意义上讲，没有酶就没有生命。
-------探讨酶的本质和发展问题是酶学研究的内容。
酶包括：
（1）Enzymeproteins酶是由生物体产生的具有催化剂活性的蛋白质
（2）RibozymeRNAs本身就是一段RNA，不需要额外的蛋白酶就可以对自身进行剪切。
酶具有一般催化剂的特征：
1.只能进行热力学上允许进行的反应；
2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；
3.通过降低活化能加快化学反应速度。
2、酶工程（EnzymeEngineering）概念
酶的生产、改性与应用的技术过程。
是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。
酶工程是酶制剂的大批量生产和应用的技术，它从应用的目的出发，将酶学理论与化学工程相结合，并在一定的反应装置中利用酶的催化特性，将原料转化为产物的一门新技术。
第一章 酶学基础知识
第一节酶的概念和作为生物催化剂的特点
第二节酶的化学组成和结构
第三节酶的命名与分类
第四节酶的高效催化机理
第五节酶的调节机理
第六节影响酶催化作用的因素
第七节酶的活力测定
第一节酶的概念和作为生物催化剂的特点
一、酶的概念
现代科学证明，酶是能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子。
二、酶作为生物催化剂的特点P15
作为生物催化剂的酶，既有与一般催化剂相同的催化性质，又具有一般催化剂所没有的生物大分子特征。
酶与一般催化剂的共同点是：
只能催化热力学所允许的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点；
在化学反应的前后，酶本身没有质和量的改变；
很少的量就能发挥较大的催化作用；
其作用机理都在于降低了反应的活化能（actlvatlonenergy）。
而酶作为生物催化剂，与一般催化剂相比又具有以下明显的特性：
1．极高的催化效率（高效性）P17
2.酶的专一性P16
酶对其所催化的底物和反应类型具有严格的选择性，一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，催化一定类型的化学反应，并生成一定的产物，这种现象称为酶的专一性（specificity）或特异性。
（1）绝对专一性P16
（2）相对专一性P16
（3）立体异构专一性P16
3．酶活性的可调节性P17
酶是细胞的组成成分，和体内其他物质一样，在不断地进行新陈代谢，酶的催化活性也受多方面的调控。
通过酶分子化学结构的变化：
酶原激活，共价修饰调节等
通过酶分子立体结构的变化：
别构效应
通过酶分子含量的变化：
阻遏与诱导，激素控制等
这些调控作用保证了酶在体内的新陈代谢中发挥其恰如其分的催化作用，使生命活动中的种种化学反应都能够有条不紊、协调一致地进行。
4．酶的不稳定性，要求温和的反应条件P15
酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40°C。
第二节酶的化学组成和结构
－、酶的化学组成P9
1．酶的化学本质和化学组成P9
酶的化学本质是蛋白质，最直接的证据是对所有已经高度纯化和结晶的酶进行一级结构分析，结果都表明酶是蛋白质。
蛋白质根据它的组成成分可分为单纯蛋白质和结合蛋白质两类。
酶是具有特殊催化功能的蛋白质，也可根据酶的组成成分，分为单纯酶和结合酶两类。
（1）单纯酶
单纯酶（simpleenzyme）是组成成分仅为氨基酸的一类酶。
消化道内催化水解反应的酶（如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等）均属于此类酶。
这些酶只由氨基酸组成，不含其他成分，其催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
（2）结合酶
结合酶（conjugatedenzyme）的基本组成成分除蛋白质部分外，还含有非蛋白质的小分子物质。
蛋白质部分称酶蛋白（apoenzyme），小分子物质称辅助因子（cofactor）。
酶蛋白与辅助因子单独存在时，都没有催化活性，只有两者结合成完整的分子时，才具有活性。
这种完整的酶分子称为全酶（holoenzyme），
即：
全酶＝酶蛋白十辅助因子。
据酶分子组成分类
单纯酶
结合酶
酶蛋白
辅助因子
小分子有机物
金属离子
（全酶）
酶促反应的专一性及高效率取决于酶蛋白部分
而辅助因子决定酶促反应的性质
2．酶的辅助因子
在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同:
酶反应的专一性取决于酶蛋白本身，
而辅助因子则直接对电子、原子或某些化学基团起传递作用，决定反应的性质。
酶的辅助因子可以是金属离子，也可以是小分子有机化合物。
常见酶含有的金属离子有K+、Na＋、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。
它们或者是酶活性中心的组成部分
（催化作用变价催化eg:
Fe2+、Mn2+、Cu2+
都有变价：
Cu+Cu2+；Fe2+Fe3+;Mn2+Mn3+的互变）；
或者是连接底物和酶分子的桥梁；
或者是稳定酶蛋白分子构象
（结构作用不能变价eg:
Zn2+）。
金属酶（metalloenzyme）
金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。
金属激活酶（metal-activatedenzyme）
金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。
辅助因子也可以是小分子有机化合物
维生素或者维生素的衍生物
酶的辅助因子（决定酶促反应的类型）
根据与酶蛋白结合牢固程度划分：
辅酶：
与酶蛋白结合疏松，可用透析法除去辅助因子
辅基：
与酶蛋白结合紧密，用透析法不能除去
从化学本质上划分：
金属离子：
稳定酶分子构象；参与传递电子；
辅助因子在酶与底物间起连接作用；降低反应的静电斥力。
维生素B族衍生物
二、酶的分类
（一）按酶的分子组成分类：
单体酶：
由单条肽链构成,仅具有三级结构的酶，多是水解酶。
寡聚酶：
由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。
多酶体系：
由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。
多功能酶或串联酶：
一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。
1、 单体酶-一般由一条肽链组成。
但有的由多条肽链组成，肽链间通过二硫健相连形成一个共价整体。
分子量一般在13000-35000。
一般是催化水解反应的酶。
由两个或两个以上亚基组成，亚基可相同可不同，之间非共价键结合，彼此很容易分开。
2、 寡聚酶---由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
分子量很高，在几百万以上。
如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合酶复合体等。
3、 多酶复合体--刚才已经提到多酶复合体是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。
它有利于一系列反应的连续进行。
这类多酶复合体的分子量很高，一般都在几百万以上，例如在脂肪酸合成中的脂肪合成酶复合体。
一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。
由单肽链构成的，含有若干个酶活性的结构域
4、多功能酶或串联酶：
（二）按酶在代谢途径中的地位、含量及活性分
恒态酶是指构成代谢途径和物质转化体系的基本组成成分的酶，其在细胞内的含量相对恒定，活性仅受反应动力学系统本身的组成因素调节。
调节酶是指在代谢途径和物质转化体系中，起调节作用的关键酶，其含量与组成常因机体的机能状况而改变，活性受多方调控。
（三）按酶分成的机制分
组成酶是细胞中天然存在的酶，其合成速度恒定，与环境变化及诱导物无关。
诱导酶是天然条件下酶的合成速度较低，一旦在底物或衍生物等诱导物存在时，酶蛋白的合成速度剧增，以适应环境的改变和需要。
三、酶的结构与功能的关系
1.酶分子的结构特征P12
（1）酶分子的一级结构
酶蛋白的一级结构是指构成酶蛋白的20种基本氨基酸的种类、数目和排列顺序。
根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。
1.非极性R基氨基酸（共8种）：
丙氨酸（Alanine,Ala,A）,
亮氨酸（Leucine,Leu,L）,
缬氨酸（Valine,Val,V））,
异亮氨酸（Isoleucine,Ile,I）,
苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe,F）,
色氨酸（Tryptophan,Trp,W）,
甲硫氨酸（Methionine,Met,M）,
脯氨酸（Proline,Pro,P）
2.无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：
丝氨酸（Serine,Ser,S）,苏氨酸（Threonine,Thr,T）,
酪氨酸（Tyrosine,Tyr,Y）,半胱氨酸（Cysteine,Cys,C）,
天冬酰胺（Asparagine,Asn,N）,甘氨酸（Glycine,Gly,G）,
谷氨酰胺（Glutamine,Gln,Q）
3.带正电荷的极性R基氨基酸（碱性氨基酸）（共3种）：
赖氨酸（Lysine,Lys,K）,精氨酸（Arginine,Arg,R）,
组氨酸（Histidine,His,H）
4.带负电荷的极性R基氨基酸（酸性氨基酸）（共2种）：
天冬氨酸（Asparticacid,Asp,D）,
谷氨酸（Glutamicacid,Glu,E）
基本氨基酸的分类
根据R侧链基团性质的不同，可将氨基酸进行分类：
杂环氨基酸、芳香族氨基酸与脂肪族氨基酸
极性氨基酸与非极性氨基酸
1、按照R基的化学结构分类
（1）R为脂肪烃基的氨基酸（5种）
（2）R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）
（3）R中含有酰胺基团（2种）
（4）R中含有酸性基团（2种）
（5）R中含碱性基团（3种）
（6）芳香族氨基酸
（7）杂环族氨基酸（1种）
2、极性分类可分为：
非极性氨基酸：
Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe,Trp,Met。
极性氨基酸：
Gly,Tyr，Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；Lys,Arg,His;Asp,Glu.
组成酶蛋白的氨基酸的数目和种类与其催化的反应性质及酶的来源有关。
一级结构不仅研究多肽链中氨基酸的排列顺序，还包括二硫键的位置。
在一级结构中，有些酶的-SH参与组成酶的活性中心，是活性中心最重要基团之一。
有些酶的二硫键对维持酶的活性很重要，或通过-S-S-与-SH互变表现酶的活性。
（2）酶分子的空间结构
酶分子的空间结构即是维持酶活性中心所必需的构象。
酶分子的肽链以β折叠结构为主，折叠结构间以α螺旋及折叠肽链段相连。
β折叠为酶分子提供了坚固的结构基础，以保持酶分子呈球状或椭圆状。
β-折叠
酶分子（或亚基）的三级结构是球状外观。
在三级结构构建过程中，β折叠总是沿主肽链方向于右手扭曲，构成圆筒形或马鞍形的结构骨架。
α螺旋围绕着β折叠骨架结构的周围或两侧，形成紧密曲折折叠的球状三级结构。
当片层比较大时，β折叠在空间不是平面的，而是扭曲的
α-螺旋
由于非极性氨基酸（如苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丙氨酸Ala等）在β折叠中出现的几率很大，因此在分子内部形成疏水核心，而表面则多为α螺旋酸性氨基酸（Asp、Glu）残基的亲水侧链所占据。
除少数单体酶外，大多数酶是由多个亚基组成的寡聚体，亚基间的空间排布，即是酶的四级结构。
亚基之间缔合状态的不同决定了酶的活性高低。
亚基间主要依靠疏水作用缔合，范德华力、盐键、氢键等也具有一定作用。
亚基数目以双亚基和四亚基居多。
亚基的排布以对称型较多。
（3）酶分子功能部位的划分
酶分子球形结构表面，存在着多种功能性区域。
酶分子的主要生物学功能是催化特异的化学反应，因此与催化有关的功能区域（如活性中心）自然是酶学研究的重点。
但是，酶除具有催化功能外，还有其他一些生物功能，亦即分子中存在着其他功能部位，如抑制剂、激活剂、别构效应剂结合部位，亚基间相互识别、相互结合部位，与酶在膜上定位和定向有关的区域，以及酶蛋白中相对独立功能的小区（即酶分子模体）等，这些都是与催化功能直接或间接相关的部位。
因此，对酶活性中心以外的功能区域的研究，也是酶学研究需重视的内容。
2．酶的活性中心与必需基团P12
酶与其他蛋白质的不同之处就在于，酶分子的空间结构上具有特定的有催化功能的区域。
对酶分子结构的研究证实，在酶分子上，并不是所有氨基酸残基，而只是少数氨基酸残基与酶的催化活性有关。
这些氨基酸残基虽然在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并催化底物转化为产物，这一区域称为酶的活性中心（activecenter）或活性部位（activesite）。
单纯酶中，活性中心常由一些极性氨基酸残基的侧链基团所组成，如His的咪唑基、Ser的羟基、Cys的巯基、Lys的ε-氨基、Asp和Glu的羧基等。
而对结合酶，除上述基团以外，辅酶或辅基上的一部分结构往往也是活性中心的组成部分。
酶活性中心内的一些化学基团，是酶发挥催化作用及与底物直接接触的基团，称为活性中心内的必需基团（essentialgroup）。
就功能而言，活性中心内的必需基团又可分为两种：
与底物结合的必需基团称为结合基团（bindinggroup），
催化底物发生化学反应的基团称为催化基团（catalyticgroup）。
结合基团和催化基团并不是各自独立的，而是相互联系的整体。
活性中心内有的必需基团可同时具有这两方面的功能。
还有一些酶活性中心以外的基团，虽然不直接参与酶的催化作用，但对维持酶分子的空间构象及酶活性是必需的，称为活性中心以外的必需基团。
注意
具有相似催化作用的酶往往有相似的活性中心。
如多种蛋白质水解酶的活性中心均含有Ser和His，处于这两个氨基酸残基附近的氨基酸序列也十分相似。
以核糖核酸酶A为例
活性中心的共性
（1）活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
（2）活性部位是一个三维实体。
（3）活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
（4）活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。
（5）酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。
酶的活性中心
酶的活性中心
酶的活性部位具有三维空间结构。
构成酶活性中心的几个氨基酸，它们在一级结构上并不紧密相邻，由于肽链的折叠和卷曲而彼此相互靠近，形成有特定空间结构的区域。
，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（induced-fit）
活性中心空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。
酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补，在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的。
酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙内。
裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合
底物靠许多弱的键与酶结合。
蛋白质分子中的非共价键（次级键）
1.氢键
氢键（hydrogenbond）的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。
氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。
氢键的键能较低（~12kJ/mol），因而易被破坏。
蛋白质分子中氢键的形成
2.疏水键
非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。
蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。
3.离子键（盐键）
离子键（saltbond）是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。
在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。
蛋白质分子中离子键的形成
4．范德华氏（vanderWaals）引力
原子之间存在的相互作用力。
活性中心的重要化学基团
7种氨基酸出现的频率最高
LysAspGluCysHisTyrSer
（兰天果拌猪肉丝）
某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基
和咪唑基）是酶的必需基团。
赖氨酸Lys的氨基
天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu的羧基
半胱氨酸Cys的巯基
组氨酸His的咪唑基
酪氨酸Tyr和丝氨酸Ser的羟基
研究酶活性中心的方法
1.物理学方法：
用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。
2.化学修饰法P13
根据所用修饰试剂不同，分为
1）非专一性化学修饰
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团被修饰后：
酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团
酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团
但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。
2）专一性化学修饰（基团专一性修饰）
用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。
3）亲和标记（位点专一性修饰）
采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。
作用机制：
利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。
酶的结构不是固定不变的，而是具有一定的柔性。
1958年D.Koshland提出诱导契合学说：
当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于底物结合或催化的变化。
同时，底物分子构象也发生相应变化。
酶和底物在这个基础上互补契合，进行反应。
第四节酶的高效催化机理P17
1．酶的作用在于降低反应活化能P22
在任何化学反应中，反应物分子必须超过一定的能阈，成为活化的状态，才能发生变化，形成产物。
这种从初始反应物（初态）转化成活化状态（过渡态）所需的能量，称为活化能（energyofactivation，Ea）。
催化剂的作用，主要是降低反应所需的活化能，以相同的能量能使更多的分子活化，从而加速反应的进行。
备注：
反应的自由能改变（△G）与催化剂存在与否没有关系
图l－2对非催化反应和催化反应的活化能与自由能变化的比较表明，非催化反应的Ea大于催化反应的Ea′，而对其自由能的变化没有影响。
酶是生物催化剂，同样能显著地降低反应的活化能，因而表现出极高的催化效率。
2·酶促化学反应的中间产物学说P22
酶之所以能降低活化能，加速化学反应，可以用目前比较公认的中间产物学说来解释。
大量实验证明，酶促反应是分两步进行的。
酶（E）催化某一反应时，首先与底物（S）结合，生成一个不稳定的过渡态中间复合物——酶-底物复合物（ES），此复合物再进行分解，释放出酶和形成产物（P）。
之后酶又可再与底物结合，继续发挥其催化功能。
其过程可用下式表示。
E＋S=ES→E＋P
由于E与S结合生成了ES，致使S分子内部某些化学键发生变化，呈不稳定状态或称过渡态，这就大大降低了S的活化能，使反应加速进行。
有实验证据表明，酶-底物中间复合物是客观存在的，有些已经分离得到。
例如：
D-氨基酸氧化酶与D－氨基酸结合而成的复合物已被分离并结晶出来。
3．酶作用高效率的机理
酶促反应中过渡态中间复合物的形成，导致活化能的降低是反应顺利进行的关键步骤，任何有助于过渡态形成的因素都是酶催化机制的一个重要组成部分。
现已证实，至少有以下7种效应包含在酶的催化机理中。
（l）邻近效应和定向效应P23
邻近效应（approximationeffect）是指底物结合于很小体积的活性中心后，使活性中心的底物浓度得以极大提高，并同时使反应基团之间互相靠近，提高反应速度。
在生理条件下，底物浓度一般约为0.001mol／L，而酶活性中心的底物浓度达100mol／L，因此在活性中心区域的反应速度必然大为提高。
定向效应（orientationeffect）是指底物的反应基团与催化基团之间或底物的反应基团之间正确地取向所产生的效应。
因为邻近的反应基团之间如能正确取向或定向，有利于这些基团的分子轨道交盖重叠，分子间反应趋向于分子内反应，增加底物的激活，从而加速反应。
对酶催化来说，“邻近”和“定向”虽是两个概念，但实际上是共同产生催化效应的，只有既“邻近”又“定向”，才能迅速形成过渡态，共同产生较高的催化效率。
（2）应变效应（指底物分子的形变或扭曲）P23
酶受底物诱导后可能发生构象改变，特别是活性中心的功能基团发生位移或改向，产生张力作用，促使底物扭曲，削弱有关的化学键，从而使底物从基态转变成过渡态，有利于反应进行。
（3）酸碱催化P24
广义的酸碱催化（acid-basecatalysis）是指质子供体和质子受体的催化。
酶之所以可以作为酸碱催化剂，是由于很多酶活性中心存在酸性或碱性氨基酸残基，例如羧基、氨基、胍基、巯基、酚羟基、咪唑基等。
它们在近中性pH范围内，可作为催化性质的质子受体或质子供体，有效地进行酸碱催化。
例如，蛋白质分子中His的咪唑基，其pKa＝6.0，在生理条件下以酸碱各半形式存在，随时可以接受H+，速度极快，半衰期仅lO-10s，是个活泼而有效的酸碱催化功能基团。
因此，His在大多数蛋白质中虽然含量很少，但却很重要。
这很可能是由于在生物分子进化过程中，它不是作为一般的结构分子，而是被选择作为酶活性中心的催化成员而保留下来。
代谢过程中的水解、水合、分子重排和许多取代反应，都是因酶的酸碱催化而加速完成。
（4）共价催化P25
共价催化（covalentcatalysis）是指酶对底物进行的亲核、亲电子反应。
某些酶能与底物形成共价结合的ES复合物，亲核的酶或亲电子的酶分别释放出电子或吸取电子，作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，以加速反应进行。
其中，亲核催化最重要。
通常酶分子活性中心内都含有亲核基团，如Ser的羟基、Cys的巯基、His的咪唑基、Lys的ε-氨基，这些基团都有剩余的电子对，可以对底物缺电子基团发动亲核攻击。
（5）金属离子的催化P25
有的酶中含有与酶催化有关的金属离子。
这些金属离子有的可以帮助酶分子传递电子；有的具有“超酸催化作用”，即由于金属离子比H+浓度高、电荷多，所以比H+有更强大的催化功能；有的可以通过”金属桥”结合底物分子。
（6）活性中心的低介电性P25
酶活性中心内部是一个疏水的非极性环境，其催化基团被低介电环境所包围，某些反应在低介电常数的介质中反应速度比在高介电常数的水中的速度要快得多。
这可能是由于在低介电环境中有利于电荷相互作用，而极性的水对电荷往往有屏蔽作用。
（7）协同催化
即某一酶的催化中并不只有一种效应，而往往是多种效应共同存在，这些效应协同作用。
上述降低酶活化能的因素，在同一酶分子催化的反应中并非各种因素同时都发挥作用，然而也并非是单一的机制，而是由多种因素配合完成的。
第五节酶的调节机理P17
各种代谢反应是通过酶活性调控来实现的。
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