中国药科大学考研生物化学课件.docx

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中国药科大学考研生物化学课件

第三章氨基酸（2学时）

§3.1氨基酸——蛋白质的构件分子

§3.2氨基酸的分类

§3.3氨基酸的酸碱化学

§3.4氨基酸的化学反应

§3.5氨基酸光学活性和光谱性质

§3.6氨基酸混合物的分析分离

§3.1氨基酸——蛋白质的构件分子

一蛋白质的水解

二α-氨基酸的一般结构

氨基酸在中性pH时，以兼性离子形式存在。

§3.2氨基酸（aminoacid）的分类—三种分类方法

1非极性氨基酸：

9种，其结构如下

2极性不带电荷的氨基酸：

6种

3带正电荷的氨基酸：

3种

4带负电荷的氨基酸：

2种

5几种不常见氨基酸的结构式

根据R基团的结构或性质特点，巧记20种氨基酸的口诀

甘、丙、缬、亮、异、脂链（脂肪链R基团的五种）

丝、苏、半、蛋、羟硫添（含-OH，S者共四种）

天、谷、精、赖、组、酸碱（酸性、碱性者五种）

脯、酪、苯、色、杂芳环（芳杂环R基者四种）

天冬酰胺、谷酰胺（两种酰胺）

都有密码属“常见”（常见氨基酸都有特异的遗传密码）

§3.3氨基酸的酸碱化学

1氨基酸的两性解离性质：

是电泳法、离子交换法分离氨基酸的基础

氨基酸在晶体或水溶液中主要以兼性离子（zwitterion）形式存在。

它在溶液中的带电荷情况，随溶液的pH的变化而不同。

2氨基酸的等电点

在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该种氨基酸的等电点（isoelectricpoint，pI）

对侧链不解离的氨基酸：

pI=（pKa1+pKa2）/2

对于酸性氨基酸：

pI=（pKa1+pKR）/2

对于碱性氨基酸：

pI=（pKa2+pKR）/2——可用酸碱滴定曲线来确定。

例子：

求Glu的等电点

分析：

pk值↓，越在较低的pH下解离离,∴α-羧基最先解离，α-氨基最后解离，

根据pI的意义，就有:

pI=（pKa1+pKR）/2=（2.19+4.25）/2=3.22

3氨基酸的酸碱滴定曲线（甲醛滴定）

由于氨基酸的等电点不是过高，就是过低，没有适当的指示剂可被选用。

加入过量的甲醛，降低了氨基的碱性，当用NaOH滴定就使滴定终点的pH下降。

通过滴定曲线求pI：

每种氨基酸是在它的pKa值附近，而不是它的pI处发挥其缓冲作用。

在等电状态下，氨基酸净电荷为零，且解离成阳离子

§3.4氨基酸的化学反应

一α-氨基参加的反应

1与亚硝酸的反应：

是α-氨基所特有的反应，是VanSlyke氨基氮测定的基础。

反应中放出的氮，一个来自HNO2，一个来自氨基酸。

2与甲醛反应：

甲醛滴定测定氨基酸含量及pKa

3与DNFB的反应：

是Sanger用于测多肽氮端的基础

多肽的N端的氨基酸残基与DNFB反应，可用来测多肽的N端氨基酸

4与PITC的反应：

是Edmann降解测氮端氨基酸及多肽的序列测定的基础

PITC可用于多肽的序列测定

5与DNS-Cl的反应：

用于测多肽的N端氨基酸

二α-羧基参加的反应：

1成盐和成酯反应，2成酰氯反应等

三α-氨基和α-羧基共同参加的反应：

与茚三酮的反应——用于定性、定量测定氨基酸

四侧链R基的反应

§3.5氨基酸光学活性和光谱性质

一氨基酸的光学活性和立体化学

120种标准氨基酸中，除Gly（R：

H）外都具有旋光性。

从蛋白质温和水解得到的氨基酸都是L-型。

2Thr、Ile除α-C是不对称碳原子外，还有第二个C*，有四个异构体

二氨基酸的光谱性质

§3.6氨基酸混合物的分析分离

一薄层层析：

薄层层析是分配层析的一种。

进行定性和定量测定。

二离子交换层析是分离、分析氨基酸的有效方法

选择一定的pH和离子强度的缓冲溶液进行洗脱，不同氨基酸和树脂的结合能力不同，在洗脱过程中将依次被从柱子上洗出，而达到分离的目的。

三氨基酸的电泳分离

电泳（electrophoresis）是指带电质点在电场中的移动。

移动速率（μ）∝Q/r。

式中Q是指质点所带的净电荷，可用（pI-pH）的差异表示，r是质点的半径。

例子：

Lys、His、Leu、Glu在pH6.0的缓冲溶液中进行电泳，结果如图，请指出各氨基酸在图中的位置。

第四章蛋白质（4学时）

第一节蛋白质通论

一蛋白质的化学组成和分类二蛋白质分子的形状及大小

三蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次四蛋白质功能的多样性

一蛋白质的化学组成和分类

1蛋白质的组成

蛋白质的元素组成：

蛋白质由C、H、O、N、S等元素组成。

有些蛋白质还含有其它一些元素，如P、Fe、Cu、I、Zn和Mo等。

其中N在蛋白质中的平均含量为16%，是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算基础：

蛋白质含量=蛋白氮×6.25

蛋白质的化学组成：

单纯蛋白质仅由氨基酸构成；但缀合蛋白质还有其它成分。

2蛋白质的分类

②根据蛋白质的溶解度分：

见P158表4-1

二蛋白质分子的形状及大小：

蛋白质的分子质量变化范围大，大约6000∽1×106

三蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次

蛋白质的结构具有不同的组织层次，依次为：

一级（1°）结构是指多肽链的氨基酸序列

二级（2°）结构是指多肽链主链在空间的伸展

三级（3°）结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。

四级（4°）结构是指寡聚蛋白质中各亚基之间上的相互关系和结合方式

四蛋白质功能的多样性

1结构成分2蛋白质是细胞原生质的主要成分3催化功能

4免疫功能5调节功能6运动功能7运输功能8贮存功能

§4.2肽

一肽键和肽链（peptidebondandpeptidechain）

肽键是蛋白质分子中氨基酸之间的主要连接方式，即一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基之间脱去一分子水相互连接。

书写多肽时，从N端开始连续写到C端。

肽链主链单调重复，多肽的区别在于侧链

二肽键的结构和肽平面：

肽键实质上是一种共振杂化体。

其中反式构型比较稳定，因此，肽链中肽键都是反式构型.

三肽的性质

1肽可被水解：

酸、碱和酶都可以作用于肽，使其完全或部分水解

2肽的解离性质

3肽的化学反应：

双缩脲反应（biuretreaction）

四生物活性肽

1谷胱甘肽（GSH）：

是存在于动、植物和微生物细胞中的一个重要的三肽，由Glu、Cys和Gly所组成。

GSH是某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要作用。

2α-鹅膏蕈碱（α-amanitin）：

是一个环状八肽，能与真核生物的RNA聚合酶（RNApolymerase）Ⅱ和Ⅲ牢固结合而抑制酶的活性，因而使RNA的合成不能进行，但不影响原核生物的RNA的合成。

3脑啡肽：

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽

4催产素和加压素：

催产素：

使子宫和乳腺的平滑肌收缩，具有催产和排乳作用；

加压素：

使血管平滑肌收缩，而升高血压，并有利尿作用

§4.3蛋白质的一级结构及测定

有两条途径：

一是直接测定多肽链的氨基酸顺序；另一条是间接的，即从编码蛋白质的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。

直接法测定蛋白质的氨基酸顺序包含如下内容：

n获得高纯度的单一蛋白质样品,测其分子量大小

n确定肽链数目（末端分析法）

n氨基酸的组成分析

n打开-S-S-键

n肽链的部分水解

n肽段的氨基酸顺序测定

n片段重叠,拼出完整的氨基酸顺序

n确定-S-S-键及酰胺基的位置

1氨基酸的组分分析—可推测部分水解所产生的肽碎片的数目：

将蛋白质样品进行酸水解,水解条件:

6mol/LHCl110℃封闭水解24、48、72小时。

结果:

Trp被破坏;Ser、Thr有不同程度的损失,Asn→Asp；Gln→Glu

2N末端分析：

DNFB或DNS-Cl法,DNS-Cl是一种更有效的方法,灵敏度比DNFB法高100倍

3C末端分析

肼解法最常用。

还原法：

C末端氨基酸也可用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇。

肽链完全水解后，代表原来C末端氨基酸的α-氨基醇可用层析法加以鉴别。

4肽链的部分断裂

（1）BrCN法：

它专一性地水解Met的羧基形成的肽键。

结果产生以高丝氨酸内酯结尾的肽。

（2）NH2OH法：

能专一性地断裂-Asn-Gly-之间的肽键。

但-Asn-Leu-和-Asn-Ala-之间的键也能部分断裂。

（3）酶法：

常用胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（又称糜蛋白酶，chymotrypsin）

5肽段的氨基酸顺序分析

（1）Edman降解法—与PITC作用生成PTH氨基酸。

现在多用氨基酸自动分析仪测定。

（2）羧肽酶法（carboxypeptidasemethod）

羧肽酶A：

从C端依次降解末端残基。

但C末端残基为Lys、Arg和Pro时或倒数第二个氨基酸是Pro时，该酶均不起作用。

羧肽酶B：

专门水解C末端的Lys和Arg，但倒数第二个氨基酸是Pro时，该酶不起作用。

羧肽酶C：

能水解C末端的Pro及其它残基。

6重叠法推导多肽的氨基酸顺序

胰酶：

得4个肽段：

Ala.Arg；Arg；Met.Phe.Ala.Lys；Asp.Phe.Leu.Lys

糜酶：

得3个肽段：

Ala.Arg.Arg.Met.Phe；Ala.Lys.Asp.Phe；Leu.Lys

全顺序：

Ala.Arg.Arg.Met.Phe.Ala.Lys.Asp.Phe.Leu.Lys

§3.4蛋白质的氨基酸序列与生物功能

1同源蛋白质的物种差异与生物进化

同源蛋白质（homologousprotein）指在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质。

不变残基（invariantresidue）

可变残基（variableresidue）

顺序同源（sequencehomology）：

同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性。

可核对物种之间的分类学关系及绘制进化树（evolutionarytree）。

2蛋白质一级结构的个体差异—细微变化可直接影响其功能

以血红蛋白（Hemoglobin，Hb）为例。

1949年，LinusPauling对HbA和HbS研究

发现：

1954年，VernonIngram确定了HbA和HbS分子结构上的差异：

β链1234567

HbAVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys

HbSVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys。

镰刀型贫血病—由基因突变引起的一种分子病

3一级结构的断裂和酶原的激活——胰岛素原的激活

§4.5蛋白质的空间结构

一蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质

1二级结构（secondarystructure）的概念：

是多肽链的主链在空间的走向，不涉及侧链。

多肽链的构象可用肽平面间的扭角来描述。

Cα-N键旋转的角度用φ表示，Cα-C键用ψ表示,它们被称为二面角。

Φ以Cα-C对N-H呈反式时为0°。

Ψ以Cα-N对C-O呈反式时为0°。

肽平面就成为肽链盘绕折叠的基本单位，也是蛋白质会形成各种立体构象的根本原因。

常见的二级结构单元有α-螺旋、β-折叠和β-转角。

2α-螺旋

n多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，每圈螺旋含3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm。

n肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行。

第一个氨基酸残基的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。

影响α-螺旋的稳定性的因素：

α-螺旋的稳定性与多肽链的氨基酸组成有关。

v一般来说，Gly、Pro不易形成α-螺旋，两个或两个以上相邻的残基带相同的电荷时，如polyLys和polyGlu不易形成α-螺旋。

v两个或两个以上相邻的氨基酸残基上带有较大的侧链时，如Ile.Ile.Ile,Val.Val.Val,Leu.Leu.Leu等,都会阻止α-螺旋结构的形成连续的几个Ser或Thr，由于羟基与氢键有强烈相吸的倾向，而破坏α-螺旋的形成。

α-角蛋白的结构

3β-折叠（β-pleatedsheet）：

是肽链主链或某一肽段的一种相当伸展的结构，多肽链呈扇面状折叠。

β-折叠的形成一般需要两条或两条以上的肽段共同参与，相邻肽链上的氨基和羰基之间形成有规则的氢键，维持这种片层结构的稳定。

其结构要点如下：

（1）所有的肽键都参与了链间氢键的形成，氢键在反平行的β-折叠结构中，两条肽链的走向相反，但氢键与肽链的长轴近于垂直。

（2）多肽主链是比较伸展的，取锯齿状折叠构象；侧链R交替地分布在片层平面的上方和下方。

（3）β-折叠有平行和反平行两种。

丝心蛋白是典型的反平行的β-折叠片

4β-转角（β-turn）：

蛋白质分子的多肽链在形成空间构象时，经常会出现180°的回折（转折），回折处的结构就称为β-转角结构。

一般由四个连续的氨基酸组成。

第一个氨基酸的羧基和第四个氨基酸的氨基之间形成氢键。

Gly和Pro易出现在这种结构中。

二蛋白质的三级结构和球状蛋白质

蛋白质的三级结构（TertiaryStructure）是指蛋白质分子中所有原子在空间的排列，包括它们的二级结构要素（如α-helix、β-sheet等）和它们的侧链基团在空间的相互关系。

1三级结构的某些特征（共性）

1）含有α-helix、β-sheet，但两者的比例和组合在各种蛋白质中不相同。

2）侧链的定位随极性而变化，极性基团位于表面；非极性基团位于分子里面，形成疏水的核。

3）超二级结构（supersecondarystructure）即基元（motif），在许多蛋白质中常见到二级结构要素组合，有βαβ基元、β-发夹基元、αα基元、βββ基元。

4）结构域（domain）：

分子较大的多肽常折叠成两个或多个球状簇，这种球状簇叫域或结构域，大多数域为100~200个残基构成的平均直径约为2.5nm，结构域常具有特殊的功能，如：

结合小分子（3-磷酸甘油醛脱氢酶同NAD+的结合属于这种情况。

2蛋白质空间结构稳定的因素

蛋白质多肽链在生理条件下折叠成特定的空间构象显然是热力学的一种有利过程，是各种作用力相互平衡的结果

1）离子相互作用：

蛋白质分子中相反电荷基团的相互作用。

2）氢键。

3）偶极间的相互作用。

4）疏水相互作用：

维持蛋白质空间构象稳定和形成的最重要作用力，疏水作用是由于蛋白质多肽链中的疏水残基有避开水的倾向，彼此在分子内产生的作用力，这种力是维持蛋白质分子稳定的主要作用力。

5）-S-S-键：

是维持某些蛋白质结构稳定性的主要因素。

它是由两个Cys的侧基-SH氧化而形成。

-S-S-的形成不是推动蛋白质天然结构形成的作用力。

3肌红蛋白（myoglobin）的结构和功能

是由一条多肽链（含153个残基）和一个血红素辅基构成。

多肽主链由长短不等的8段α-helix组成，8段螺旋大体上组装成两层，构成肌红蛋白的单结构域。

三蛋白质的四级结构与寡聚蛋白质

1概念：

蛋白质的四级结构（QuaternaryStructure）是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。

就构成了寡聚蛋白质的四级结构的内容。

这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，它一般由一条肽链构成，无生理活性；由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白

2寡聚蛋白质与别构效应

Ø别构效应（allostericeffect），有些蛋白质表现其生物功能时，其构象发生变化，从而改变了整个分子的性质，具有这种效应的蛋白质称作别构蛋白质。

别构蛋白质多是寡聚蛋白质。

Ø活性部位（activesite）与别构部位（allostericsite，或称调节部位regulatorysite）。

Ø同位效应和异位效应

3血红蛋白的结构与功能

1血红蛋白的结构：

血红素铁的微小移动导致Hb构象的转变。

Hb除运输O2外，还运输H+、CO2；另外对血液还具有缓冲作用。

2血红蛋白的氧合曲线

3波尔效应（H+、CO2促进O2的释放）

波尔效应可概括为下列过程：

CO2对Hb的影响如下：

4BPG降低Hb对O2的亲和力

O2的S型结合，波尔效应以及BPG效应物的调节，使得血红蛋白的输氧能力达到最高效力。

同时由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，使机体内的氧不致有很大的起伏。

此外血红蛋白使机体的pH也维持在一个较稳定的水平

§4.6蛋白质的结构与功能的关系

1蛋白质的一级结构决定其高级结构

核糖核酸酶（Rnase）的变性与复性说明形成复杂的三维结构所需要的全部信息都包含在它的氨基酸排列顺序上，蛋白质分子多肽链的氨基酸排列顺序包含了自动形成正确的空间结构所需要的全部信息，即一级结构决定其高级结构。

由于蛋白质特定的高级结构的形成，出现了它特有的生物活性。

2一级结构相同的蛋白质功能也相同

促肾上腺皮质激素（ACTH）与促黑激素（α-MSH）两者的N-端的13个氨基酸完全相同，仅α-MSH的N-端为乙酰化的氨基酸。

若将ACTH分子从C-端逐渐切，仅剩下N-端的13个氨基酸，则ACTH的活性完全消失，而具有显著的α-MSH的活性。

3蛋白质的空间结构与功能

生物体内各种蛋白质都有特定的构象,而这种构象是与它们各自的功能相适应的。

O别构效应

O变性作用

§4.7蛋白质的分离、纯化及表征

一蛋白质的胶体性质

1蛋白质在溶液中的稳定性

2透析法除去蛋白质样品中的小分子杂质—纯化蛋白质

3盐析和盐溶

盐溶现象：

在盐浓度很稀的范围内，随盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度增加，这种现象称盐溶（salting-in）。

盐析现象：

随盐浓度进一步增加，如达到饱和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度大大降低，彼此之间相互凝集而发生沉淀，此现象称盐析（salting-out）。

盐析后，用透析法除去小分子。

如用硫酸镁和硫酸铵盐析法从牛胰脏中提取胰蛋白酶和糜蛋白酶。

4蛋白质的沉淀

1）盐析法

2）有机溶剂沉淀法

3）重金属盐沉淀法

4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法

5）加热沉淀法

6）等电沉淀法

二蛋白质的两性解离性质—是电泳和离子交换层析分离蛋白质的基础

1蛋白质的两性解离

在等电状态下，蛋白质的溶解度最小。

易结集而沉淀下来，可把蛋白质混合物彼此分开。

2蛋白质的电泳分离

在外电场作用下，带电质点向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。

其泳动速率

对蛋白质电泳主要是聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）。

凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成。

最大的特点是可根据需要选择凝胶的孔径。

非变性电泳和变性电泳

q非变性电泳：

蛋白质样品未进行变性处理，凝胶中没加入变性剂。

分离后的蛋白质仍有活性（分离取决于q/r）。

q变性电泳：

SDS-PAGE，SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂。

能使蛋白质变性，肽链伸展，并吸附在伸展的肽链上，吸附量与链长成比例。

这样，大小不同的肽链具有相同的荷质比，可根据蛋白质多肽链的大小使其分离。

常用来测蛋白质亚基组成的数目和大小及鉴定蛋白质的纯度。

3离子交换层析法分离蛋白质

在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合能力取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，而后者又与溶液的pH有关，盐的存在可降低离子交换剂的离子基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。

因此蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成，与离子交换剂结合力最小的蛋白质最先由层析柱中洗脱出来。

层析洗脱时，可采用保持洗脱剂成分一直不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱剂的盐浓度或pH的方式洗脱。

三蛋白质的变性作用与复性

1变性作用（denaturation）：

蛋白质受物理或化学因素影响，分子的空间构象破坏，从而导致其理化性质、生物学活性改变的现象称为蛋白质的变性作用。

剪切、超声波；强酸、强碱、重金属盐类、有机溶剂、脲、胍类等都可使蛋白质变性。

蛋白质变性后，溶解度降低，生物活性丧失或部分丧失。

因此，可利用使蛋白质变性的方法，将其从溶液中沉淀下类，使之分离。

2蛋白质复性（renaturation）：

某些蛋白质变性后可以在一定条件下恢复原来的空间构象，使生物活性恢复，这个过程称为蛋白质的复性。

四蛋白质的沉降作用与超离心分离

在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力与溶剂的摩擦阻力平衡时，每单位离心场强度的沉降速度为定值，称为沉降系数（sedimentationcoefficient）。

单位以S表示，1S=1×10-13秒。

沉降速度与蛋白质分子的大小和密度有关

沉降速度法适合于分离沉降系数不同但密度相近的蛋白质。

沉降平衡法适合于沉降系数相近但密度不同的蛋白质

五蛋白质分子的大小与凝胶过滤

凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据分子量的大小。

常用的凝胶有交联葡聚糖（sephadex）和琼脂糖（sepharose）。

洗脱时比凝胶孔径大的分子最先流出；最小的分子因为能渗透到所有孔洞中而最后流出

六蛋白质配体的特异性与亲和色谱

根据蛋白质对特殊物质的亲和性进行分离的一种方法。

如酶与底物、抗体与抗原等

§4.8蛋白质含量的测定

一紫外吸收法

1A280吸收法：

该法快速、简便、不消耗样品。

2A280和A260吸收差法：

当样品不纯，尤其含有核酸时常用此法。

经验公式为：

蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

二福林酚法（folin法）：

蛋白质与福林试剂作用生成蓝色化合物。

在一定的浓度范围内，所产生颜色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。

三染料结合法（Bradford法）

蛋白质与考马斯亮蓝G-250试剂反应，产生一种亮蓝色的化合物，在595nm有最大吸收。

在一定浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。

注意：

未结合蛋白质之前，染料试剂本身为棕褐色，在465nm有吸收。

该法快速、简便，干扰因素少。

缺点是蛋白质溶液的浓度不能太高。