第1篇第11章内分泌细胞学技术.docx
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第1篇第11章内分泌细胞学技术
第十一章内分泌细胞学技术
细胞培养
内分泌细胞培养的应用
探索各种内分泌细胞的功能，各种激素的作用方式及其对机体的影响是内分泌基础研究的主要目标之一，而各种激素在发挥功能的过程中大多是与相应的靶细胞结合而发挥作用。
体外细胞的培养，使上述研究更加直接和有效。
【细胞培养】
细胞培养（cellculture）：
是指从体内分离细胞、在体外模拟体内的环境（包括无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件下等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。
培养物常为单个细胞或单一细胞群，特殊情况下可用不同组织来源的细胞共同培养。
细胞培养的出现，开创了生命科学研究新的里程碑，使生命科学不再受组胚学、解剖学的局限，以活的有机体做研究对象。
目前，细胞培养不仅是生命科学理论研究的重要技术方法，细胞移植和细胞治疗也逐渐应用于临床，而且日益成为生物工程和基因工程的生产手段。
一、细胞分离
细胞分离是指将细胞或细胞团从组织块中游离出来，而原已存在于体液中的细胞如血液中的细胞则不需分离，可直接纯化。
一般采用机械法或酶消化法，前者指用机械手段如剪刀、玻璃注射器蕊、细胞匀浆器等将组织块变成小于2mm3的组织甚至单个的细胞或细胞团；后者指用能分散细胞外基质的酶将细胞从其支持组织中分离出来。
常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、高纯度分散酶，它们又有各种不同的类型。
实际应用时，应针对不同的组织来源，采用不同的类型和酶浓度。
经上述方法分离的细胞一般为多种细胞及细胞外基质的混合物，如果要得到单一细胞群，则需进一步纯化。
（一）筛网过滤法选择孔径比细胞直径稍大的不锈钢或尼龙膜网，分离后的细胞经无菌的筛网过滤，孔径比细胞大的物质便留在筛网上。
该方法只能对细胞进行初步纯化，对细胞类型比较单一的组织块如除去包膜的脾脏细胞等是有效的，而对于其他细胞如胰岛等则需进一步的纯化。
（二）密度梯度离心使用不同浓度的Ficoll（含葡聚糖）形成不同的密度梯度，细胞置于Ficoll上或与它们共同组成密度梯度，在适当离心力下进行离心，吸取特定细胞层，即可分离目的细胞[1]。
经密度梯度离心后的细胞已经达到了较高的纯度，为常用的一种细胞纯化方法。
（三）显微镜下直接吸取细胞或刮取细胞层为获得单克隆细胞或排除其他细胞的污染，对于体积较大（如胰岛）或有显著特征（如ALP染色阳性细胞）的细胞，可在显微镜下无菌吸（刮）取细胞，以达到纯化目的[2]。
（四）选择性培养在培养基中加入非目的细胞的特异性抑制物，使得非目的细胞不能增殖并诱发其凋亡，从而使细胞达到纯化[3]。
该方法常用在杂交瘤细胞或转基因细胞的选择性培养中。
（五）流式细胞技术将细胞荧光染色（对细胞无毒，仍可存活）后，在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50~100μm的小孔并排列成单行，每个细胞依次恒速通过激光束照射区，细胞受激光照射后发出散射光和荧光。
通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。
如果受检测的细胞特性与预定的细胞特性相符，则该细胞被收入到特定的容器中，从而将细胞分离[4]。
（六）共聚焦激光扫描显微镜技术利用共聚焦激光扫描显微镜，在不改变培养环境及细胞生长状态的情况下，利用高能激光自动杀灭非目的细胞，存留完整活细胞亚群继续培养，从而克隆粘附细胞。
二、离体细胞的培养
（一）培养液由基本培养基及补充物所组成，对来源于体液的细胞如外周血淋巴细胞而言，选用RPMI1640培养液较好。
对贴壁培养的细胞，可选用DMEM、MEM、F12、McCoy’S5A,F10或DMEM/F12混合物。
其中F12、F10较常用于成纤维细胞的培养，DMEM、MEM、McCoy’S5A较常用于上皮细胞的培养。
同一类型的基本培养基其组成成份不同，有高糖型、低糖型，有些含有酚红。
对于高糖需要型细胞如胰岛培养，则选用高糖型培养液。
而研究类固醇激素对细胞的影响时，应选用无酚红的培养液以排除酚红的类固醇激素样作用。
补充物有动物血清、生长因子和激素等，部分生长因子与激素是醇溶性的，此时要注意培养液中的乙醇浓度不要超过0.1%（V/V），各种生长因子和激素的配制与使用方法如表1-14-1。
表1-14-1生长因子及激素的配制和使用
溶剂
贮存浓度
贮存温度（℃）
使用浓度
L-抗坏血酸
PBS
50mg/ml
4
25μg/ml~100μg/ml
上皮生长因子（EGF）
H2O
2μg/ml
-20
1ng/ml
成纤维细胞生长因子
H2O
2μg/ml
-20
5ng/ml
丙酮酸钠
H2O
100mM
4
1mM
氢化可的松
95%乙醇
2×10-4M
4
2×10-6M
地塞米松
PBS
10-5M
4
10-7-10-8M
雌激素
95%乙醇
10-3M
4
10-8M
维生素A酸
95%乙醇
2×10-6M
-20
2×10-8M
胰岛素
0.01NHCl
1mg/ml
4
5μg/ml
动物血清常用5%~15%小牛血清或胎牛血清（FBS），必要时可用活性炭将血清中的各种生长因子、激素及免疫球蛋白等吸附去除（炭吸附血清，CS-FBS），以满足细胞培养中的特殊需要[5]。
我们用0.1%BSA（牛血清白蛋白）代替CS-FBS用于肿瘤细胞的培养，效果良好[6]。
同时Sigma公司有去除不同细胞因子和激素的血清替代物出售（serumreplacement），它们亦能满足特殊培养中的部分需要。
（二）培养介质除血液、脾脏、胸腺等来源的细胞外，哺乳动物细胞的培养一般采用贴壁培养。
将分离后的细胞加入适量培养液（占培养空间的5%~20%，V/V），置于37℃、5%CO2、95%空气及保和湿度下培养，而昆虫细胞如Sf9细胞则不能耐受37℃的高温[7]，最适培养温度为27℃。
原代贴壁培养的细胞在培养的前2~3天保持不动，以保证细胞有充足的贴壁时间，过早搬动则会导致细胞不能贴壁而使培养失败；继代培养的细胞贴壁相对较快，肿瘤细胞更快，在接种的24小时内基本上已能贴壁。
有些组织来源的细胞在玻璃或常规聚合材料制成的培养瓶中较难贴壁，须在瓶壁上附一层基质如鼠尾胶原等[8，9]，这样更能保证培养细胞的功能接近于体内。
三、细胞的传代
当细胞培养达到85%~95%汇合时，即可进行传代培养，用胰酶或EDTA将细胞进行消化（有些贴壁不紧的肿瘤细胞如HEK-293细胞等只需轻轻吹打而不需消化就能将细胞分散[10]），使细胞回缩呈透亮的圆形，加入冷的Hank液终止消化，离心收集细胞，按1:
2至1:
4将细胞分成等份继代培养。
四、培养细胞的检测
各种细胞既具有相同的特性，又有其独有的特性。
本节所介绍的是各种细胞共有特性的检测。
（一）细胞形态学观察生长状态良好的细胞，镜下可见细胞透亮、轮廓欠清，胞内无异常颗粒，原代正常组织细胞常呈规律排列，而肿瘤细胞排列比较杂乱。
细胞功能不良时，透光性下降，轮廓增强，胞内常出现不透明的异常颗粒及空泡、脂滴等，细胞被微生物污染时，培养基变浑浊或瓶内出现异常生长物，细胞形态发生改变，生长缓慢甚至脱落，镜下亦可见有异常活动的微生物出现。
同时还可将培养液取出少许涂片，乙醇固定，Giemosa染色后油镜下观察微生物形态。
如怀疑有衣原体或支原体污染，可用低张处理的嗜伊红染色观察。
图1-14-1细胞分裂指数和细胞数量的关系
（二）细胞增殖计数将消化后的细胞接种24孔板，分7组，每组3孔，培养一周。
每天取出一组细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，用计数盘或细胞自动计数器计数，取3孔的平均值直至第7组结束，用座标图纸绘制成生长曲线，如图1-14-1。
（三）有丝分裂指数（mitoticindex:
MI）是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数（分裂细胞/1000），用以表示细胞增殖旺盛程度[11]。
因此在检测中需观察和记录群体中1000个细胞中的细胞分裂相数，即细胞分裂指数=
×100。
具体方法是在培养瓶中加无菌洗净的盖玻片，每日从瓶中抽出盖玻片进行固定、染色（对于悬浮培养的细胞，则取一滴细胞悬液滴片后固定），制成永久性标本。
镜下观察分裂相并计数。
取得逐日分裂相计数后，可绘成细胞分裂指数曲线，如图1-14-1。
（四）流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成当细胞培养至80%左右汇合时，胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，在流式细胞仪上测出细胞所处的周期相（G1、G2、S、M期）和DNA合成的周峰期，同时可测RNA含量[4]。
（五）细胞内总蛋白含量测定将细胞用TritonX100-Tris缓冲液裂解，离心后取上清，用Bradford方法测上清液中蛋白质浓度，测定时用牛血清白蛋白作为标准，标准液与待测样品均用考马斯亮兰G-250染色，在紫外分光光度计590nm波长处测出它们的吸光度。
根据不同蛋白浓度的标准液所对应的吸光值，分光光度计可自动得出所测样品的蛋白质浓度。
五、细胞株的建立
原代培养的正常细胞特别是内分泌细胞，其增殖的能力有限甚至有的根本不能传代。
因而必须将它们变成永生性细胞，以利于进一步的研究，但同时要设法保留原有细胞的大部分功能特性。
常用的方法为人工诱变，即用射线、温度、药物、病毒和化学致突物诱导细胞突变[11]。
其中以病毒和化学致突物常用（所用病毒一般为基因缺陷型病毒，它们丧失了在体外感染人和动物的能力；化学致突物常为强烈致癌剂，使用时一定要加强防护），如用EB病毒可转化正常人外周血淋巴细胞，腺病毒可转化肾小管上皮细胞。
大部分细胞株的建立是直接取肿瘤组织进行分离培养，肿瘤细胞虽然为低分化细胞，但同时也具有部分分化细胞的特性，因而在研究分化细胞的某一方面的特性时，常可用某一类似的细胞株来代替，目前在内分泌方面常用的细胞株如表1-14-2。
表1-14-2内分泌常用细胞系
分类
组织来源
特性
MG-63
成骨肉瘤细胞系
14岁女性成骨
肉瘤
多倍体细胞株,能产生大量
胶原,能分泌ALP,具有
体外矿化能力
Saos-2
成骨肉瘤细胞系
人
能分泌大量ALP、合成胶
原能力不及MG-63
ROS17/2.8
成骨肉瘤细胞系
大鼠
MC3T3-E1
成骨样细胞系
小鼠颅骨转化
细胞株
UMR106
前成骨样细胞系
大鼠
MBA-1
骨髓基质细胞系
大鼠
可分泌Ⅰ，Ⅲ型胶原，可
体外培养成骨
INS-1
胰岛B细胞系
鼠
能对生理状态下的葡萄糖
刺激产生反应，并分泌
胰岛素
NES2Y
胰岛素分泌细胞株
持久性高胰岛
素血症的病
人
缺乏机能敏感性的钾通
道，胰岛素基因调节转
录因子PDXI缺乏
HIT-T15
胰腺B细胞系
鼠
MIN6
胰腺B细胞系
鼠
NPA
甲状腺乳头状癌细胞系
人低分化甲状
腺乳头状癌
TT
甲状腺髓样癌细胞系
WRO
甲状腺滤泡状癌细胞株
ARO/FRO
甲状腺癌细胞系
未分化甲状腺
乳头状癌
CHO-K1
卵巢细胞系
中国仓鼠
ST
睾丸细胞系
猪
PC-12
肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系
鼠
CoC1
卵巢癌细胞系
人
Anglne
卵巢癌细胞系
人
T47D
乳腺癌细胞系
人
FLG29.1
破骨前体细胞系
人
在适当诱导下可分化成成
熟破骨细胞
六、细胞冻存和复苏
某一培养物建成后，如暂不使用，可冷冻保存。
细胞消化后，离心收集，用冻存液[完全培养基加5%~10%的二甲基亚砜（DMSO）]重悬细胞，使细胞数为4×106个/ml，以1ml/管装入冻存管，经程序性降温后最终放入液氮中长期保存。
如果无程序降温仪，可将细胞在4℃放2小时，然后转入－70℃放12~24小时，最后快速转入液氮中保存。
当要使用该细胞时则可从液氮中取出细胞，放入39℃温水中快速解冻，解冻时间不要超过1分钟。
见细胞完全解冻后，便从温水中取出，尽快用缓冲液离心洗去DMSO，重新加培养液培养。
【内分泌细胞培养的应用】
一、细胞培养药物测试
新药在应用于临床之前，需进行药效检测。
细胞培养能使药物与靶细胞直接接触，如防治糖尿病药物直接与胰岛接触，抗骨质疏松药物直接与成骨细胞或破骨细胞接触。
有时甚至可以将药物显微注入细胞内，能使细胞较快的发生反应，避免了动物试验中药物引起靶腺反应周期长等缺点，且细胞发生的各种改变可通过多种方法检测。
药物细胞测试时，被检测的药物最好为水溶性，这样便可用基本培养液作为对照。
如果药物为非水溶性，应安排一组溶剂对照以排除溶剂对细胞的影响。
同时必须考虑到溶剂的浓度不宜过高，否则会因为对细胞的影响太大而掩盖药物的作用。
（一）药物浓度分组体外培养的细胞所处的微环境有别于体内，对药物的耐受性也可能不同，一般选用体内生理浓度的近似值，同时向上向下拉开2~3个浓度梯度，如某一药物体内的生理浓度为10-8M，则应选用10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等进行处理，如为复方制剂或无体内生理浓度参考值，则应测出药物对该细胞的半效应量（mediainfectivedose,ID50）[11]。
方法是将药物分成不同的浓度梯度，用这些浓度的药物干预细胞，台盼蓝染色观察细胞死亡一半时的浓度，即为半效应量。
然后在该浓度上下寻找精确的最佳浓度，药物试验一般每组需设3个以上平行孔/瓶，特别是要对细胞进行免疫检测和放射性分析时，平行孔/瓶最好达到5个以上。
（二）给药时间可于接种前和生长中给药，以生长中给药常用。
根据不同的检测目的，生长中给药的时间不同，如测药物对细胞增殖的影响，可在增殖高峰期前2~3小时给药；检测药物对某一代谢分泌产物的影响时，可在接近该分泌产物达最高前给药，药物处理时间一般不得少于8小时，最长可与细胞培养时间同步。
（三）给药后检测给药后检测的方法较多，包括细胞增殖、信息的传递、基因的表达、酶或蛋白质的分泌等。
要注意的是在检测酶或蛋白质的分泌时，要注意保持其活性，大部分操作最好在低温下进行。
二、细胞工程产品
因体外培养的细胞与机体细胞一样，能分泌出各种酶和蛋白质，因而细胞培养日益成为生物工程药物（如各种抗体）和基因工程药物的生产手段。
将外源性的目的基因导入细胞，连接合适的启动子，细胞在一定的诱导条件下便能表达目的基因的产物，且在真核生物细胞中表达的产物，其活性普遍比原核生物中的要高。
三、细胞移植
因器官移植具有强烈的免疫排斥反应，因而细胞移植得到广泛的发展，而且目前的大多数基因治疗均是以细胞作为载体，将目的基因导入细胞，植入机体，导入的基因便可代替缺陷的基因发挥正常作用，有些细胞如杀伤细胞（TIL细胞）、Lark细胞等本身对癌细胞有杀伤作用[12]，将这些细胞植入机体后，便能杀死癌细胞，从而起到治疗作用。
四、胰岛细胞培养及应用
（一）胰岛的分离胰岛分离的胰腺标本一般来源于人、猪、鼠。
胰腺组织最好即取即分，如暂不能分离，可将组织放4℃保存，一般来说，保存时间不宜超过18小时。
1．机械分离法胰腺经4℃肝素生理盐水清洗后切取，清除被膜、血管后，将其剪成2~3mm3大小的碎块，用XB-II型细胞悬液制备器（上海放射医学研究所制）研磨[13]，使胰岛组织变成细胞悬液。
如无细胞悬液制备器，也可在玻璃匀浆器中研磨，经400目不锈钢筛网过滤后即得初胰岛。
该分离方法简单，但由于过多机械操作，对细胞损伤较大。
2．胰酶消化法上述胰腺剪碎后，不用匀浆或细胞悬液制备器研磨，而是加入胶原酶溶液。
在37℃恒温水浴箱中振摇消化5~6分钟，将消化不完全的组织吸出，再置入稀释1倍的胶原酶溶液中消化，每次3分钟，连续4~5次，至消化完全[14]。
该方法较机械分离法有所改进，但仍不能排除机械损伤。
3．导管内胶原酶灌注法该方法常用于从活体动物胰腺分离胰岛，先从低位总胆管插入一根导管，并在开口处结扎（鼠可用2号套管结扎，人胰腺可用18号套管结扎），以防止胶原酶漏入十二指肠，然后分别结扎左右肝管。
处死动物后，用不同浓度的胰酶（可用I型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅹ型、Ⅺ型，胶原酶P等，1~6mg/ml）通过导管注入胰腺使其均匀扩大，然后切除胰腺，并置于冰冷容器中，加入Hank’s溶液，在37℃温育消化后，放入冷（4℃）的Hank’s溶液中。
吸取液体轻轻冲洗胰腺组织，使其进一步分散成悬浮液，以50×g离心10秒钟，弃上清，反复冲洗离心两次后，通过筛网过滤，便可得到各种分散的细胞悬液[15]。
该方法可避免机械操作对胰岛的损伤，分离出的胰岛存活率较高，是较普遍采用的一种分离方法。
图1-14-2全自动分离胰岛流程图
4．全自动分离胰岛法导管内胶原酶分离胰岛虽然省去机械操作对胰岛的影响，但由于各部分胰岛从胰腺分离出来的速度不一，先分离出的胰岛不能及时从胶原酶溶液中移走，任何一种胶原酶对细胞均有毒性，且其毒性随作用时间的延长而增大，分离出的胰岛因在胶原酶溶液中消化时间过长而使其功能受到抑制。
Ricord等改进了前述方法，设计出一种自动分离胰岛的方法[16]。
按前述方法从导管内注入胶原酶后（胶原酶的体积大致相当于胰腺重量的2倍），将胰腺放入全自动分离器的小分离室中（如图1-14-2）。
分离室由上下两个不锈钢室组成，其间用280μm孔径的不锈钢筛网隔开，分离室的总容积为300ml，下面的不锈钢室呈圆柱状，包含有两个输入口，侧壁上连一个温度探测器。
该两个入口接上一个热循环器（由蛇形管放入温水中组成），热循环器与蠕动泵相连，蠕动泵的另一端接有一个循环柱，循环柱上方置有一个94μm孔径的过滤网和一个双向开关并与一装有Hank溶液的容器相连，分离上室的出口接有冷循环器（蛇形管放入冰水中组成），蛇形管的另一端通过双向开关与循环柱和收集瓶相连。
下室放7个1cm直径的玻璃球，上室成圆锥形，有一个输出端口，上下室用螺丝固定，整个分离室与一个摇柄相连。
当胰腺放入分离室后，在下室内加入胶原酶溶液，密闭上下室，启动摇柄，胰腺在室内振摇消化。
同时Hank溶液经过滤网达到循环柱上层，然后再经过蠕动泵（40ml/分）及热循环器而达到37℃，进入下分离室，稀释下分离室中的胶原酶，并使下分离室达到37℃，消化后的液体（其中含胰岛）通过280μm孔径的筛网进入冷循环，使得胶原酶灭活后，再流入循环柱的底层。
循环柱和冷循环器均放置冰水中，从而保护胰岛，而冷的剩余消化液又可通过循环柱顶层的过滤器进入分离室中继续消化，胰岛则留在了分离柱的底层，这样整个系统就变成了一个开放的分离系统。
当样品中检测到有游离出的胰岛时，关闭循环柱和热循环器，缓慢注入新的Hank’s液稀释胶原酶并降低温度继续消化，直到新的分离液中再也检测不到胰岛时止，整个分离过程只需30~60分钟，分离出的胰岛悬液贮存在新的培养瓶中。
该方法分离出的胰岛活性高，功能好，整个胰岛细胞团的结构保持较完整。
因而较常用该方法分离胰岛进行异体移植。
以后，该方法又不断得到完善，如扩大密闭室的容积，改善胶原酶的质量[18]。
许多种胶原酶（collagenase）如I型、Ⅳ型、Ⅱ型、Ⅹ型、Ⅺ型、P型使得胰岛分离的效果越来越好。
另一种新的多酶混合物——liberase[18]，又使得分离胰岛的质量大大提高，但因其价格极其昂贵，尚未广泛应用。
（二）胰岛纯化
1．转皿与碘乙酸抑制分离出的胰岛悬浮液经筛网（400~500目）过滤后尚含有大量的外分泌细胞、导管上皮细胞、成纤维细胞等，因导管上皮细胞及成纤维细胞贴壁速度较胰岛快，可把接种后的胰岛细胞培养12小时后转皿。
此时胰岛细胞尚未贴壁，而导管上皮细胞及成纤维细胞已大部分贴壁，转皿后可除去部分导管上皮细胞及成纤维细胞，然后加入碘乙酸处理3~5小时，碘乙酸能抑制成纤维细胞生长，而对胰岛的影响较小（注意：
碘乙酸对皮肤有强烈的腐蚀性，使用时要注意勿粘到皮肤），经该方法处理后的胰岛纯度不高，因而较少采用。
2．密度梯度离心根据胰岛B-细胞与其他细胞的比重不同而分离胰岛。
用葡聚糖或商用菲可400（Ficoll-400）组成不同的密度梯度。
如可用27%、23%、11%浓度的葡聚糖分层装入管中，其中置细胞悬液，经离心后可在11%与23%的浓度界面收集胰岛[19]；也可在一个200ml的离心筒中，先放入100ml密度为1.074g/cm3的Ficoll梯度分离液，然后另取40ml的Ficoll分离液与10ml的细胞悬液混合，使其密度为1.058g/cm3，轻置于1.074g/cm3的梯度离心液上，以800×g在4℃下离心16分钟，选取第2层（约50~80ml）收集细胞[16]；或将细胞离心沉淀后用25%的Ficoll溶液重悬，置于离心管的底层，其上依次加入23%、20%和11%的Ficoll溶液，在4℃以750×g离心10分钟，在上面两层分界面收集胰岛[15]。
3．经密度梯度离心后分离的胰岛已具有较高的纯度，如需进一步纯化可用双硫腙（dithizone,DTZ）对胰岛细胞进行染色[20]。
DTZ为螯合指示剂，可与铅、铜、锌等螯合，人和动物（豚鼠除外）的胰岛B细胞因含锌，DTZ染色呈猩红色，而其他胰腺细胞及非胰岛细胞不着色，故DTZ对胰岛呈特异性染色，而且经DTZ染色后的胰岛仍可培养，功能不发生改变。
DTZ可用酒精或二甲基亚砜（DMSO）配制，配制方法为：
DTZ10mg溶于3ml无水乙醇（含50μl浓NH4OH），加Hank液12ml。
此为储存液，临用时用Hank液（pH7.8）1:
1000稀释，0.22μm滤过膜过滤后与胰岛制备物混合，室温放置10分钟。
或将10mgDTZ溶于10mlDMSO，用Hank’s液（pH7.8）1:
1000稀释，过滤后与胰岛制备物混合，室温放置10分钟，在相差显微镜下观察，胰岛细胞呈红色。
用特制的吸管或注射器针头在显微镜下吸取胰岛，经吸取后的胰岛已具有足够的纯度。
4．使用荧光分类器或流式细胞仪分离将细胞进行荧光染色在荧光分类器下分离胰岛[21]，或预先确定胰岛的大小，用流式细胞仪分离胰岛。
该两种方法因需昂贵的仪器，因而使用尚未普及。
（三）胰岛的鉴定
1．活性测定主要包括：
①台盼蓝或DTZ染色：
台盼蓝能穿透死细胞的细胞壁，将死活细胞区分开来，在显微镜下计数能得出分离胰岛的存活率。
另外，因DTZ对胰岛染色的特异性，用上述DTZ染色方法能较快的鉴定胰岛。
②活细胞荧光染色：
利用吖啶橙（AO）-碘丙啶（PI）双色荧光染色鉴别死亡的细胞与活细胞[22]，AO为浸润性染料，可侵入活细胞而发出绿色荧光；PI为排斥性染料，不能进入活细胞，与死亡的或正在死亡的细胞核酸结合，发出红色荧光，其区分死活细胞的灵敏度比台盼蓝染色高。
2．胰岛细胞鉴定除用上述DTZ染色的简单染色方法外，还可用荧光标记胰岛素抗体对胰岛细胞进行免疫荧光染色鉴定。
3．胰岛功能检测
（1）胰岛素释放试验在光学显微镜的目镜上装一个标准光栅测出胰岛的直径，按表1-14-3所列方法将胰岛换算成150μm直径的当量胰岛数目（equivalentisletnumbers,EIQ）[23]，接种相同当量数的胰岛，每天取上清测胰岛素的含量，7天后作胰岛素释放试验。
（2）胰岛葡萄糖灌注试验将50~100个胰岛置于含滤膜的微型滤器中进行真空抽滤灌注[24]，第一与第三小时用葡萄糖液和Krebs液灌注各1小时，于最末20分钟收集灌注液，第二小时用葡萄糖加茶碱灌注，于不同时间收集灌注液检测胰岛素含量，绘制胰岛素分泌动态图，按下述公式计算刺激指数（SI）：
SI=第二小时前20分钟分泌胰岛素含量+后20分钟分泌胰岛素含量/第一小时末20分钟分泌胰岛素量+第三小时末20分钟分泌胰岛含量[19]。
表1-14-3不同直径级的胰岛转化150μm直径胰岛当量数的方法
胰岛的直
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