莲花SRAPPCR体系的优化.docx

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莲花SRAPPCR体系的优化

河南师范大学

本科毕业论文

莲花SRAP-PCR体系的优化

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姓名：

指导教师：

2010年5月

莲花SRAP-PCR体系的优化

摘要:

采用正交试验设计法对影响SRAP-PCR反应的TaqDNA聚合酶、Mg2+和dNTPs浓度进行了优化，同时对DNA模板浓度进行了筛选。

建立了莲花25μlSRAP-PCR的反应体系为：

Mg2+浓度为1.8mM，Taq酶为1.5U，dNTPs浓度为1.6mM和模板DNA浓度为400ng/μl。

实验结果显示，运用优化的SRAP-PCR反应体系获得的DNA条带清晰、扩增结果稳定、多态性较丰富。

关键词：

离子注入莲花突变体；SRAP-PCR反应体系；正交设计；优化

OptimizationandformationSRAP-PCRsysteminlotus

Abstract:

ThesystemofSRAPinlotuswasoptimizedincludingtheconcentrationofMg2+,dNTPs,TaqEandDNAtemplate.Alotus25ulSRAP-PCRreactionsystemwasestablished,including1.8mMMg2+,1.5UTaqenzyme,1.6mMdNTPsand400ng/μlDNAtemplate.Clear,stableandabundantpolymorphicbandswereobtainedundertheoptimalreactionsystem.

Keywords:

Ionimplantationlotusmutation;SRAP-polymerasechainreaction（PCR）system;Orthogonaldesign;Optimize

SRAP标记，相关系列扩增多态性（Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism）是一种新型的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性[1]。

该标记通过独特的引物设计对ORFs（openreadingframes）进行扩增，上游引物长17bp，5’端前10个碱基为“填充”序列（fillersequence），无任何特异组成，接着为CCGG序列，它们组成核心序列及3＇端3个选择性碱基，对外显子进行特异扩增。

下游引物长18bp，5＇端前11个碱基为“填充”序列，紧接着是AATT，它们组成核心序列及3＇端3个选择性碱基对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。

因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。

该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建[2]、比较基因组学[3]和遗传多样性分析[4]。

近年来，以分子标记为重点的植物分子生物学研究迅猛发展，为研究品种之间的遗传差异提供了新的方法和手段，分子标记技术和DNA指纹分析技术已广泛应用于农作物的种质鉴定。

SRAP、RAPD、ISSR、AFLP技术已被大量的运用在莲藕的遗传研究上[4-10]。

离子注入诱变育种技术是近年来发展起来的物理诱变技术。

该技术以较小的生理损伤得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、使用方便、成本低廉、对人体和环境无害等优点，已在棉花，烟草，水稻等方面取得成功，本实验选用经过离子注入诱变的莲花突变体，进行SRAP分子标记，从而进行莲花遗传多样性的研究，进一步确定莲花品种演化与亲缘关系。

这不但具有重要的学术意义，而且对莲花的栽培、育种以及园林应用具有重要的指导意义[7]。

鉴于此，在保证扩增特异性和产量的基础上，对莲花SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、TaqDNA聚合酶用量，模板DNA用量和dNTP4个因子进行了优选实验，并进行了初步应用和比较，从中筛选出适宜的SRAP-PCR反应体系。

为今后利用SRAP-PCR分子标记技术进行莲花遗传多样性、品种资源鉴定、进化及系统发育等方面的研究提供实验基础。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1实验样品

离子注入莲花突变体及其对照

1.1.2试剂和仪器

1.1.2.1实验试剂

变色硅胶（青岛裕宝精细化工有限公司）；Tris碱（郑州宝赛生物科技有限公司）；β-巯基乙醇（BBI公司原装）；EDTA-Na2·2H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）；琼脂糖（郑州宝赛科技有限公司）；CTAB（上海生工生物工程技术服务有限公司）；MgCl2（25mM）、dNTPs（2.5mM）、Taq酶（5U北京天根生物科技有限公司）；Marker为λDNA/HindⅢ+EcorⅠ、上样缓冲液为溴酚兰和二甲基、RNA酶（上海生工生物工程技术服务有限公司）；SRAP引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；无水乙醇；TEMED；冰醋酸；硼酸；浓盐酸；氯仿/异戊醇；琼脂糖；冰乙酸；溴化异锭（EB10µg/ml）；饱和酚；PVP等。

1.1.2.2实验仪器

SW-CJ-1F洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；DYY-Ⅲ系列电泳设备包括DYY-III-8B稳压稳流型电泳仪、水平电泳槽（北京市六一仪器厂、沃德生物医学仪器公司）；Eppendorf梯度PCR仪（德国Eppendorf公司）；WFH-201-B型全封闭多功能紫外透射反射仪（上海精密科学仪器有限公司）；752紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；TGL-16C型台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）；座式蒸汽压力灭菌锅（上海龙杰机械装备有限公司）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；数码相机（OLYMPAS）；可调式移液器（北京吉尔森有限公司）；冰箱（-20，4℃）。

1.2方法

1.2.1总DNA的提取及检测　

采用改良的2×CTAB法提取离子注入莲花突变体及其对照DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，微量分光光度计检测总DNA的纯度及含量。

将提取的各样品的DNA用TE溶液稀释至1600ng/μl，存放于-20℃冰箱中备用。

1.2.2SRAP-PCR反应条件的筛选

离子注入莲花突变体及其对照为实验样品进行SRAP-PCR反应条件的摸索。

基础扩增体系为：

反应体系总体积25μL，包括1600ng/μl模板DNA1μl、10×PCRbuffer2.5µl、25mMMgCl21.5µl、2.5mMdNTPs1.5µl、上下游引物各0.5µl、5UTaqDNA聚合酶0.4μl，双蒸水17.1µl。

参照文献[1]和[4]合成引物序列并组合形成63对引物，用上述基础扩增体系从中初步筛选出扩增条带丰富、清晰，分布较均匀的引物组合19对，并进行二次筛选，从中筛选出最适引物，并对Mg2+，TaqDNA聚合酶，dNTPs用量和模板DNA的浓度4个因素进行单因子多水平实验，以便优化基础反应体系。

在25μL总反应体系中，Mg2+浓度分别设置1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM和1.9mM5个梯度，TaqDNA聚合酶的用量分别设置为1U、1.5U、2U3个梯度，模板DNA浓度分别设为1600ng/μl、800ng/μl、400ng/μl、267ng/μl、200ng/μl、160ng/μl，dNTP的浓度分别设为0.06mM，0.08mM，0.1mM，0.12mM，0.14mM，0.16mM，0.18mM，0.2mM，0.22mM9个梯度，为保证扩增结果的稳定性，每个梯度设两个重复。

1.2.3扩增产物的检测　

PCR扩增程序为：

94℃预变性3min；94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5个循环；94℃变性1min,50℃退火1min，72℃延伸1min,35个循环；72℃延伸7min。

反应结束后，PCR产物用1.0×TAE配制的1.8%琼脂糖凝胶电泳分离，0.5μg/ml溴化乙锭染色，在5V/cm电压下电泳分离，电泳后用天能UU-2000系列紫外分析仪紫外灯观察照相，找出特异性条带，为后续研究做准备。

1.2.4SRAP优化体系的验证　

用优化的SRAP-PCR体系及最优引物组合对离子注入莲花突变体及其对照进行扩增。

2　结果和分析

2.1不同引物组合的SRAP-PCR扩增结果

利用SRAP-PCR扩增体系对初步筛选的63对引物组合进行扩增，从中筛选出扩增条带清晰、扩增结果稳定、多态性丰富的19对引物组合，用于莲花品种的SRAP-PCR扩增，取得了较好的扩增结果，实验结果见图1。

图1不同引物的扩增结果

Fig.1SRAP-PCRamplificationpatternusingdifferentprimers

由图1可见，第18对引物组合特异片段多，其对应的引物为me9-em6，即该对引物对DNA的不同序列的区分度比较好。

2.2不同因素对莲花SRAP-PCR反应的影响

根据实验结果，选择扩增效果较好的SRAP引物组合me9-em6，以莲花品种的总DNA为实验样品，针对Mg2+、TaqDNA聚合酶、DNA模板浓度和dNTPs浓度以及用量进行单因子实验，结果见图2，3，4，5。

图2Mg2+及Taq酶浓度对扩增的影响

Fig.2EffectofdifferentMg2+andTaqEconcentrationsonSRAPamplification

1~18Mg2+浓度分别为1.5mM，1.6mM，1.7mM，1.8mM，1.9mM，2.0mM，1.5mM，1.6mM，1.7mM，1.8mM，1.9mM，2.0mM，1.5mM，1.6mM，1.7mM，1.8mM，1.9mM，2.0mM

1~18Taq酶浓度分别为1~61.0U，7~121.5U，13~182.0U

由图2可见，Mg2+浓度与Taq酶浓度对扩增结果的影响较为明显，TaqDNA聚合酶在1.5~2.0U范围内变化不大，但1.0U对实验结果影响较大，条带不清晰。

从实验成本角度考虑，确定1.5U为莲花SRAP-PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的适宜用量。

Mg2+浓度对实验结果有一定的影响。

随着Mg2+浓度增加，条带的丰度和亮度均有增加。

在1.7mM～1.9mMMg2+浓度范围内，莲花SRAP-PCR扩增结果变化不大。

由于Mg2+是酶的激活剂，浓度太高易产生非特异性扩增，因而，确定莲花SRAP-PCR扩增体系中Mg2+的适宜浓度为1.8mM。

图3dNTP浓度对扩增的影响

Fig.3EffectofdifferentdNTPconcentrationsonSRAPamplification

1~9dNTP的浓度分别为0.06mM,0.08mM.0.1mM,0.12mM,0.14mM,0.16mM,0.18mM,0.2mM,0.22mM.

由图3可知，dNTPs浓度对莲花SRAP-PCR反应结果影响比较明显，随着浓度的升高，PCR产物的产量增加，但浓度过高又易出现非特异性扩增[10,11]，故在莲花SRAP-PCR扩增体系中添加0.16mMdNTPs即可。

图4不同DNA模板浓度对扩增的影响

Fig.4EffectofdifferentDNAtemplateconcentrationsonSRAPamplification

DNA浓度分别为1600ng/μl，800ng/μl，400ng/μl，267ng/μl，200ng/μl，160ng/μl

由图4可见，模板DNA浓度扩增结果的影响最明显。

过低时条带不清晰，故将莲花SRAP-PCR扩增体系中模板DNA的适宜用量确定为400ng/μl。

综合以上结果，初步确定莲花SRAP-PCR扩增体系为：

在25μl反应体系中，包含400ng/μl模板DNA1.0μl，25mMMg2+1.8μl，2.5mMdNTP1.6μl，0.5μl上下游引物，0.5UTaqDNA聚合酶0.3μl和10×PCRbuffer2.5μl，双蒸水补足至25μL。

2.3　莲花SRAP-PCR反应体系的验证结果

采用上述莲花SRAP-PCR优化反应体系，以引物组合me9-em6对离子注入莲花突变体及其对照进行扩增，以验证该反应体系的效果，结果见图5。

图5引物em6-me9反应体系

Figure5ResultsofSRAPamplificationusingprimerem6-me9

me9:

TGAGTCCAAACCGGATG;em6:

GACTGCGTACGAATTGCA

1~5离子注入莲花突变体，6对照

由图5可见，离子注入莲花突变体及其对照的条带清晰，特异性强，区分度较好。

说明本体系完全适合用来通过SRAP-PCR来分离鉴定莲花的特异性条带。

2.4优化后的体系

综合以上结果，在保证扩增产量和特异性的基础上，为节约成本，优化后25μl反应体系见表1。

表1优化前后的反应体系比较

Table1Comparisonofoptimizedreactionsystemandformersystem

反应体系

Mg2+

（25mM）

TaqDNA聚合酶

（0.5U）

dNTPs

（2.5mM）

DNA模板

（1600ng/μl）

原始体系

1.5μl

0.4μl

1.5μl

1μl

优化体系

1.8μl

0.3μl

1.6μl

0.25μl

3.讨论

3.1　莲花SRAP-PCR扩增的影响因素分析

通常扩增程序会对PCR结果产生较大影响，但由于SRAP引物具有通用性，即不同作物可以采用相同的引物组合，因此，扩增程序对扩增结果的影响不大。

目前，SRAP-PCR反应体系中使用的扩增程序与Li等的程序[7]基本相同或稍加调整。

前5个循环退火温度较低，设为35℃，主要是考虑到较低的退火温度能确保2个引物与靶DNA部分配对；随后的35个循环中退火温度升至50℃，保证前5个循环的扩增产物在余下的循环中进行指数式扩增；如果退火温度在40个循环中都保持在35℃，则扩增片段重复性将很低。

在SRAP-PCR过程中，一般研究者采用35～45个循环[12]，而本实验采用40个循环，获得的扩增条带清晰、扩增结果稳定、多态性较丰富，能满足PCR扩增的要求。

影响SRAP扩增效果的技术环节主要包括DNA提取、扩增体系和扩增产物的检测。

由于本实验采用的DNA提取方法能够确保获得高质量的DNA，因此，DNA质量不是影响扩增结果的主要因素，而SRAP-PCR扩增体系中的各因子对不同物种扩增结果的特异性、稳定性及重复性有较大影响，因此针对特定物种对扩增体系进行优化十分必要。

通过对莲花总DNA的SRAP-PCR扩增体系的优化，初步得出以下结论：

1）在Mg2+、TaqDNA聚合酶用量、dNTPs和模板DNA用量4个因子中，模板DNA浓度对莲花SRAP-PCR扩增结果稳定性的影响最大，浓度低时，条带较少或偏弱；随着浓度增加，条带的丰度和亮度增加[12-14]；优化实验结果表明，模板DNA的适宜用量确定为400ng/μl时扩增效果最好。

2）dNTPs是PCR反应的原料，浓度过低，将影响PCR产物的产量；浓度过高，将与TaqDNA聚合酶竞争Mg2+，使反应体系中的游离Mg2+减少，造成TaqDNA聚合酶活性降低，最终导致PCR产量降低[12]。

实验结果表明，dNTPs浓度对莲花SRAP-PCR扩增结果影响比较明显。

3）TaqDNA聚合酶用量和Mg2+对莲花SRAP-PCR扩增结果影响不大。

但Taq酶浓度不宜过高，过高反而会使产物减少。

3.2　SRAP分子标记用于莲花遗传多样性研究的可行性及优点

利用SRAP-PCR优化体系对离子注入莲花突变体及其对照的总DNA进行扩增和检测，结果表明，SRAP标记能揭示莲花离子注入诱变育种较丰富的多态性，表明离子注入诱变育种对莲花的突变效果明显。

因此，可利用SRAP扩增体系对莲花的多态性进行验证，为进一步构建莲花的遗传图谱奠定了重要基础，也将促进莲属植物的分子标记及遗传育种研究进程。

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致谢