激光共聚焦扫描显微镜原理功能ppt课件.ppt

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激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalLaserScanningConfocalLaserScanningConfocalLaserScanningConfocalMicroscopeMicroscopeMicroscopeMicroscope，LSCMLSCMLSCMLSCM）-基本原理及实例应用基本原理及实例应用西西7-1032015-10研究生细胞生物学技术研究生细胞生物学技术1一种观察工具，需要前面的实验做基础免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM什么是什么是LSCMLSCM用来做什么用来做什么？

2它和荧光显微镜的关系？

它和荧光显微镜的关系？

它和电子显微镜的关系？

观察的信号如何而来？

激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM3激光共聚焦显微镜的原理激光共聚焦显微镜的原理激光共聚焦显微镜的原理激光共聚焦显微镜的原理第一部分第一部分4泛指将微小泛指将微小（分辨率分辨率0.20.2M）M）不可见或难见不可见或难见物品之影像放大物品之影像放大,而能被观察的工具。

而能被观察的工具。

目镜目镜光源光源聚焦旋钮聚焦旋钮光阑和聚光器光阑和聚光器载物台载物台物镜物镜显微镜（显微镜（显微镜（显微镜（MicroscopeMicroscope）5用于研究用于研究荧光荧光或或荧光标记物质荧光标记物质的光学显微镜。

的光学显微镜。

荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜FluorescenceMicroscopeFluorescenceMicroscope照相装置照相装置光源（汞灯）光源（汞灯）标记了荧光的样品标记了荧光的样品基本原理基本原理紫外、蓝、绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光分光镜分光镜（长通短反长通短反）物镜物镜6共聚焦显微镜成像物镜物镜标本标本针孔（针孔（pinhole）焦平面焦平面普通荧光显微镜成像普通荧光显微镜成像普通荧光显微镜成像普通荧光显微镜成像7激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM-以以激光激光作为激发光源，采用光源针孔与作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔检测针孔共轭聚焦共轭聚焦技术，对样本进行技术，对样本进行断层扫断层扫描描，以获得高分辨率光学切片的，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜荧光显微镜系统。

系统。

光源光源光学原理光学原理成像原理成像原理基于的平台基于的平台激光激光针孔的共轭聚焦技术针孔的共轭聚焦技术断层扫描断层扫描荧光显微镜系统荧光显微镜系统8荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜激发光源激发光源激发光源激发光源9荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜光学原理光学原理光学原理光学原理荧光显微镜荧光显微镜光源针孔光源针孔检测针孔检测针孔激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜分光镜分光镜光源光源检测器检测器标本标本物镜物镜10分光镜不在焦平面的发射光发射光位于焦平面的发射光发射光物镜激发光线激光器双针孔双针孔光源针孔、检测针孔双针孔共用物镜的焦点荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜光学原理光学原理光学原理光学原理共轭聚焦共轭聚焦移动激光扫描器，逐点扫描扫描扫描点光源点光源11荧光显微镜系统荧光显微镜系统样品样品荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜成像原理成像原理成像原理成像原理激光扫描共聚焦系统激光扫描共聚焦系统断层扫描技术，断层扫描技术，逐点逐行扫描成像逐点逐行扫描成像CCD成像技术成像技术，一次性成像，一次性成像XX光机光机CTCT机机12普通荧光显微镜激光共聚焦显微镜特点：

特点：

侧面有扫描器接口；侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有防振动装置；装有光路转换装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜配高数值孔径的物镜。

荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜基于的平台基于的平台基于的平台基于的平台-显微镜系统显微镜系统显微镜系统显微镜系统特点：

特点：

13激光共聚焦激光共聚焦PMT检测器伪彩色灵敏度高灵敏度高光信号光信号-电信号电信号-图像图像由计算机精确控制图像的合成和输出，由计算机精确控制图像的合成和输出，同时电信号增加放大倍数。

同时电信号增加放大倍数。

多通道荧光采集多通道荧光采集一般一般33个荧光通道和一个透射光通道，个荧光通道和一个透射光通道，分别成像分别成像荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜基于的平台基于的平台基于的平台基于的平台获取图像方式获取图像方式获取图像方式获取图像方式荧光显微镜荧光显微镜目镜或CCD真彩色所见即所得所见即所得单通道荧光采集单通道荧光采集14荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜VSVSVSVS激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微激光共聚焦显微镜镜镜镜基于的平台基于的平台基于的平台基于的平台获取图像方式获取图像方式获取图像方式获取图像方式伪彩色伪彩色15-以以激光激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚共轭聚焦焦技术，对样本进行技术，对样本进行断层扫描断层扫描，以获得高分辨率光学切片，以获得高分辨率光学切片的的荧光显微镜荧光显微镜系统。

系统。

激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。

结合在一起的高技术设备。

激光激光/光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机/图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。

图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。

16激光扫描共聚焦显微镜的优缺点激光扫描共聚焦显微镜的优缺点激光扫描共聚焦显微镜的优缺点激光扫描共聚焦显微镜的优缺点171957年，年，MarvinMinsky在他的专利中首次阐明了激光在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理1967年，年，Egger和和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面了一个光学横断面1970年，年，Sheppard和和Wilson推出第一台单光束共聚焦推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世激光扫描显微镜问世1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本技术基本成熟成熟1987年，年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜微镜激光扫描共聚焦显微镜的发展激光扫描共聚焦显微镜的发展激光扫描共聚焦显微镜的发展激光扫描共聚焦显微镜的发展18目前常见的激光共聚焦显微镜目前常见的激光共聚焦显微镜目前常见的激光共聚焦显微镜目前常见的激光共聚焦显微镜19激光共聚焦显微镜构成激光共聚焦显微镜构成激光共聚焦显微镜构成激光共聚焦显微镜构成扫描器系统荧光显微镜系统计算机图像存储与处理系统ZeissLSM-710ConfocalSystem激光光源20ZeissLSM-510ConfocalSystemZeissLSM-510ConfocalSystem21ZeissLSM-710ConfocalSystemZeissLSM-710ConfocalSystem22激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能第二部分第二部分23激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能ZOOMZOOM成像成像薄层光学切片薄层光学切片荧光定量分析荧光定量分析多维度成像多维度成像多通道同时扫描多通道同时扫描24薄层光学切片薄层光学切片薄层光学切片薄层光学切片激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能使用使用共扼光路共扼光路使非焦平面的光线被抑制，使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰。

减少了成像的干扰。

使用光色较纯的使用光色较纯的激光激光，所以成像分辨率可，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的达普通光学显微镜的1.41.4倍。

倍。

逐点扫描逐点扫描，形成光学切片，形成光学切片25牛肺上皮细胞展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节26ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节27小鼠神经元细胞高清晰成像高清晰成像高清晰成像高清晰成像28多通道同时扫描多通道同时扫描多通道同时扫描多通道同时扫描普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。

种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。

激光共聚焦显微镜可以激光共聚焦显微镜可以多激光多通道多激光多通道同时扫描，多同时扫描，多通道同时探测。

通道同时探测。

激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能29动脉内皮细胞三标记动脉内皮细胞三标记动脉内皮细胞三标记动脉内皮细胞三标记30多重荧光标记多重荧光标记多重荧光标记多重荧光标记海马DG区31绿色：

SYBR14染色，活精子红色：

PI染色，死精子绿色：

活菌红色：

死菌牛精子牛精子牛精子牛精子藤黄微球菌藤黄微球菌藤黄微球菌藤黄微球菌32拟南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia斑马鱼神经元系统，byAlbertPan，HarvardUniversity共聚焦绚丽图像共聚焦绚丽图像共聚焦绚丽图像共聚焦绚丽图像视网膜烟花，byJoshR.Sanes,HarvardUniversity33ZOOMZOOM成像成像成像成像激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细并进行精细逐点扫描逐点扫描成像，获得高分辨率图像。

成像，获得高分辨率图像。

共聚焦的优势共聚焦的优势共聚焦的优势共聚焦的优势34ZOOMZOOMZOOMZOOM成像成像成像成像35ZOOMZOOMZOOMZOOM和高分辨率扫描的极限和高分辨率扫描的极限和高分辨率扫描的极限和高分辨率扫描的极限尽量使尽量使用高数用高数值孔径值孔径油镜！

油镜！

36多维度扫描多维度扫描多维度扫描多维度扫描通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度，通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度，可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。

可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。

并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立体图像。

体图像。

XYZ扫描扫描XYT扫描扫描激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能37大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架大鼠卵细胞的细胞骨架38胚胎的结构胚胎的结构39单层面扫描单层面扫描多层叠加多层叠加切片分层叠加切片分层叠加40耳蜗基底膜耳蜗基底膜41三三三三维维维维图图图图像像像像重重重重建建建建42三三三三维维维维图图图图像像像像重重重重建建建建43三维图像重建三维图像重建三维图像重建三维图像重建动态观测动态观测动态观测动态观测44荧光定量分析荧光定量分析荧光定量分析荧光定量分析激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能使用能量稳定的使用能量稳定的激光激光作为光源，且各种参数可调作为光源，且各种参数可调。

荧光探针的荧光探针的特异性标记特异性标记：

即荧光强度与特异性标：

即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。

记蛋白的表达量成正相关。

同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过比对各组样品之间的荧光强度值，进行定量分析比对各组样品之间的荧光强度值，进行定量分析。

45荧光定量分析荧光定量分析荧光定量分析荧光定量分析随机圈取细胞，可得到所圈细胞的相对荧光强度值46荧光表达量测定荧光表达量测定荧光表达量测定荧光表达量测定利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。

积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。

47细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的水平差异。

培养时间条件下的水平差异。

48激光共聚焦显微镜技术应激光共聚焦显微镜技术应激光共聚焦显微镜技术应激光共聚焦显微镜技术应用用用用第三部分第三部分如何获得一幅好的图片如何获得一幅好的图片如何获得一幅好的图片如何获得一幅好的图片49观察的对象观察的对象观察的对象观察的对象荧光荧光荧光荧光（FluorescenceFluorescenceFluorescenceFluorescence）荧光：

荧光：

物质吸收能量后所释放出的冷发光现象通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光荧光光谱：

荧光光谱：

激发光谱通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。

发射光谱荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。

488nm525nmFITC450nm490nm50自发荧光：

自发荧光：

指组织细胞不经任何荧光染色便能够激指组织细胞不经任何荧光染色便能够激发荧光。

发荧光。

免疫荧光：

荧光抗体法产生荧光。

观察的对象观察的对象观察的对象观察的对象荧光荧光荧光荧光（FluorescenceFluorescenceFluorescenceFluorescence）外源导入荧光蛋白：

外源导入荧光蛋白：

利用转基因技术将荧光蛋白利用转基因技术将荧光蛋白基因导入细胞里，让其表达基因导入细胞里，让其表达融合蛋白而产生的荧光。

融合蛋白而产生的荧光。

组组织织和和细细胞胞中中荧荧光光的的来来源源荧光染色：

荧光染色：

很多荧光染料与组织细胞作用，能够很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。

成和功能。

51GolgiinfixedandpermeabilizedNIH3T3mousefibroblastcellswaslabeledwithgreen-fluorescentAlexaFluor488conjugateofHPAlectingreen-fluorescentAlexaFluor488conjugateofHPAlectin.Filamentousactinwasstainedwithred-orange-fluorescentAlexaFluorred-orange-fluorescentAlexaFluor568phalloidin568phalloidin.MitochondriawerelabeledwithaprimaryantibodydirectedagainstOxPhosComplexVInhibitorProteinandvisualizedusingfar-red-far-red-fluorescentAlexaFluor680goatanti-mousefluorescentAlexaFluor680goatanti-mouseIgG.Nucleiwerestainedwithblue-fluorescentDAPIblue-fluorescentDAPI.荧光抗体或荧光染料标记细胞器或亚细胞结构荧光抗体或荧光染料标记细胞器或亚细胞结构荧光抗体或荧光染料标记细胞器或亚细胞结构荧光抗体或荧光染料标记细胞器或亚细胞结构52绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（Green-FluorescentProteinGreen-FluorescentProtein，GFPGFP）活体检测：

活体检测：

由于长波能量低,细胞忍受能力强。

长时间检测：

荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白能力比荧光素强。

容易融合：

分子量较小,易与目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。

可指示外源目的基因表达及沉默内源目的基因表达238238个氨基酸组成。

个氨基酸组成。

激发波长激发波长479nm479nm发射波长发射波长508nm508nm19621962年，日本下村修（年，日本下村修（ShimomureShimomure）等首先从维多利亚水母中分离出了）等首先从维多利亚水母中分离出了GFPGFP。

20082008年，美国科学家钱永健、马丁年，美国科学家钱永健、马丁沙尔菲和下村修三人因发现沙尔菲和下村修三人因发现GFPGFP而获而获得诺贝尔化学奖。

得诺贝尔化学奖。

衍生物和突变体：

BFPBFP、CFPCFP、GFPGFP、RFPRFP、YFPYFP53ThesefusionproteinsemployarangeoffluorescentmoleculesincludingCFP,GFP,mKATE2,RFPandYFP。

各类荧光蛋白作为标签（各类荧光蛋白作为标签（各类荧光蛋白作为标签（各类荧光蛋白作为标签（tag）tag）融合细胞器特异蛋白指示细胞器融合细胞器特异蛋白指示细胞器融合细胞器特异蛋白指示细胞器融合细胞器特异蛋白指示细胞器54荧光探针与荧光标记：

荧光探针与荧光标记：

采用一定的标记物，使样品中待测采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。

物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。

这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。

荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的种类：

荧光探针的种类：

大分子探针大分子探针细胞器探针细胞器探针核酸探针核酸探针金属离子探针金属离子探针细胞电位和细胞内细胞电位和细胞内pHpH值探针值探针分子的特殊集团结合探针分子的特殊集团结合探针55荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择选择的依据：

选择的依据：

根据实验目的确定需要检定的指标；根据实验目的确定需要检定的指标；确定可供选择的荧光探针的范围；确定可供选择的荧光探针的范围；考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求；要求；考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。

情况。

标记的荧光需要在不被其他因素的干扰下能标记的荧光需要在不被其他因素的干扰下能被激光共聚焦显微镜系统检测到被激光共聚焦显微镜系统检测到56荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择多重荧光标记多重荧光标记多重荧光标记多重荧光标记原则：

尽量减小不同荧光物质间激发原则：

尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。

发射光谱的重叠。

标记要求标记要求荧光素选择荧光素选择/组合组合核复染核复染单标单标无特殊限制。

无特殊限制。

FITC,Cy2最佳；尽量不选择最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红（红外外）与与自发荧光自发荧光冲突时，采用冲突时，采用TexasRed。

PI/DAPI双标双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3（必须顺序扫描必须顺序扫描）DAPI（必须必须顺序扫描顺序扫描）三标三标FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5（必须顺序扫必须顺序扫描描）活细胞追踪活细胞追踪能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间存在、随细胞分裂进入子细胞存在、随细胞分裂进入子细胞（）显微注射；转基因技术（显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）571.1.作为亚细胞定位的标记作为亚细胞定位的标记蛋白定位在哪里呢？

蛋白定位在哪里呢？

核复染的作用核复染的作用核复染的作用核复染的作用582.2.作为整体结构的标记作为整体结构的标记图中共有多少个细胞？

图中共有多少个细胞？

阳性蛋白的表达效率是多少？

图中共有多少个细胞？

阳性蛋白的表达效率是多少？

59荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择荧光探针的选择多重荧光标记多重荧光标记多重荧光标记多重荧光标记原则：

尽量减小不同荧光物质间激发原则：

尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。

发射光谱的重叠。

标记要求标记要求荧光素选择荧光素选择/组合组合核复染核复染单标单标无特殊限制。

无特殊限制。

FITC,Cy2最佳；尽量不选择最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红（红外外）与与自发荧光自发荧光冲突时，采用冲突时，采用TexasRed。

PI/DAPI双标双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3（必须顺序扫描必须顺序扫描）DAPI（必须必须顺序扫描顺序扫描）三标三标FITC/

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