激光扫描共聚焦显微镜图文讲解.docx

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激光扫描共聚焦显微镜图文讲解

激光扫描共聚焦显微镜

吴旭

2008.10.14

高级显微镜原理

正置、倒置显微镜

细胞遗传工作站

活细胞工作站

激光显微分离系统激光共聚焦显微镜

概述

激光扫描共聚焦显微镜

（Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）生物医学领域的主要应用

通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究

高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……

ConventionalfluorescencemicroscopeConfocal

microscope

历史

1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。

1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。

1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。

1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。

1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。

ConfocalmicroscopycomesofageJGWhite&WBAmos.Nature328,183-184（09July1987

Zeiss、Leica、Meridian、Olympus

ZeissLSM510激光扫描共聚焦显微镜

ZeissLSM510META激光扫描共聚焦显微镜

ZeissLSM510META激光扫描共聚焦显微镜

NikonA1R激光扫描共聚焦显微镜

PrairieUltimaIV活体双光子显微镜

国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜

LeicaTCSSP5激光共聚焦扫描显微镜

基本原理相差、DIC常用荧光标记共聚焦原理

Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy.Thestainedportionsofthecellin

（Areducetheamplitudeoflightwavesofparticularwavelengthspassingthroughthem.

Acoloredimageofthecellistherebyobtainedthatisvisibleintheordinaryway.Lightpassingthroughtheunstained,livingcell（Bundergoesverylittlechangeinamplitude,andthestructuraldetailscannotbeseeneveniftheimageishighlymagnified.Thephaseofthelight,however,isalteredbyitspassagethroughthecell,andsmallphasedifferencescanbemadevisiblebyexploitinginterferenceeffectsusingaphase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscope.

D.Phase-contrastora

differential-interference-

contrastmicroscope

Fourtypesoflightmicroscopy.（ATheimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.Theotherimageswereobtainedbytechniquesdiscussedinthetext:

（Bphase-contrastmicroscopy,（CNomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy,and（Ddark-fieldmicroscopy.

常用荧光探针

ProteinsNucleicAcidsDNAIonspHSensitiveIndicatorsOxidationStatesSpecificOrganelles

荧光显微镜原理

明场：

透射荧光：

落射

落射的优点：

物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。

激发光损失小，荧光

效应高。

共聚焦原理

由于pinhole的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT探测器探测到，从而提高了成像效果。

通过对样品在x-y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。

如果调解焦平面在z方向的位置，连续扫描多个不同z位置的二维图像，则可以形成一个3D图像，3D

的重建需要软件的支持。

TheuniquescanningmoduleisthecoreoftheLSM510META.

Itcontainsmotorizedcollimators,scanningmirrors,individuallyadjustableandpositionablepinholes,andhighlysensitivedetectorsincludingtheMETAdetector.

Allthesecomponentsare

arrangedtoensureoptimumspecimenilluminationandefficientcollectionofreflectedoremittedlight.AhighlyefficientopticalgratingprovidesaninnovativewayofseparatingthefluorescenceemissionsintheMETAdetector.

Thegratingprojectstheentirefluorescencespectrumontothe32channelsoftheMETAdetector.Thus,thespectralsignatureisacquiredforeachpixelofthescannedimageandsubsequentlycanbeusedforthe

digitalseparationintocomponentdyes.

分光镜组件结构

共聚焦构成

•光学显微镜

•激光光源

•扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜）•光检测器

•计算机系统（数据采集、处理、转换应用）•图形输出设备

LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管

图像相关概念

RGB

三基色

图像数据位

亮度

对比度

饱和

分辩率

怎样得到样品图像

样品的标记物有合适的激发波长和发射波长荧光下观察选择合适的图象

设置激光扫描的通道参数

设置图象的属性

调节每一个通道的亮度、对比度、清晰度、背景亮度

启动

共聚焦和CCD照片的比较更大的动态范围

高灵敏度

图像背景的消除

灵活的拍照区域选择ZOOM功能

伪彩色

环境要求高

多通道图象合成

时间序列

Ca离子成像

FRAP：

FluorescenceRedistributionAfterPhotobleaching

FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。

LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制。

广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域。

荧光漂白恢复（FRAP）

人卵细胞的局部光漂白

FRAP研究ER-GFP的核转位