1生物显微技术讲稿Word文件下载.docx
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切片厚度比较好掌握。
此法多用手摇切片机切片。
（3）半薄切片法方法步骤与石蜡制片相似，但包埋剂为塑料或环氧树脂，采用玻璃刀或钢刀，切片厚度为1－2μm，不能切成连续的蜡带。
（4）冰冻切片法将待切材料快速冷冻，或固定以后再冷冻，用冰冻切片机切片，用于做原位杂交、组织化学等。
（5）滑走切片机切片法是利用滑走切片机切新鲜的或保存的材料，亦可以切经由石蜡制片法包埋的材料。
将材料夹持于夹持物中（如石蜡、火棉胶、胡萝卜等，木材软化后可直接切片），并固定于滑走切片机夹物台座上进行切片，此法切出的切片厚薄均匀、结构完整，适用于一些比较坚硬的材料。
（6）超薄切片法用超薄切片机制作超薄切片，切片厚度为500Å
左右，供电子显微镜观察用，技术要求更严格。
长江大学生命科学学院备课用纸
2、非切片法
（1）离析法用一些化学药品或酶等使细胞间的胞间层溶解，细胞彼此分离，从而得到单个、完整细胞的方法，便于研究细胞的立体结构。
该方法适用于木材导管、根尖、茎尖及叶表皮细胞及木材、药材的研究。
（2）压片法经化学药剂处理植物的器官或组织并用手工机械地使植物细胞分离，涂抹或压在载玻片上，使细胞成一薄层，便于进行观察的一种制片方法。
如染色体压片法。
（3）整体封藏法将完整细小的组织块进行处理，封藏为永存片，如叶表皮整体制片、团藻、水绵、黑根霉等装片。
（4）整体透明法用透明剂将较小的材料整体透明，经透明以后可以在显微镜下观察其内部结构。
（5）胚囊酶法分离技术对植物的胚珠进行酶解，将胚珠内部的完整胚囊分离出来，用于研究胚囊的发育、或者进一步分离出卵细胞。
（二）按是否能长期保存来分，可分为二类：
（1）临时制片法：
制片用于临时观察，不需要长期保存（如临时装片、徒手切片、冰冻切片等）。
（2）永存片制片法：
制片可以长期保存（如石蜡切片、半薄切片、超薄切片等）。
四、教学基本要求
1、要求重点掌握的技术：
石蜡制片技术（包括：
取材、固定、脱水、包埋、切片、展片、烤片、染色、透明与封藏）；
2、要求掌握的一般技术：
（1）植物其它切片制片方法（徒手切片法）；
（2）非切片制片技术（压片法、涂片法、整体透明法、酶解法等）
（3）摄影及照相机的使用方法；
五、实验项目、类型及学时分配
实验内容总学时30
周次
课序
实验内容
学时
2
1
实验一生物制片样品的选取与固定技术
中秋节、国庆节放假
7
实验二植物显微化学制片
实验三生物样品的非切片制片法
8
3
实验四植物组织分离制片――蚕豆叶表皮制片数码显微拍照技术
4
9
实验五石蜡切片（Ⅰ）样品的脱水、透明与浸蜡
10
5
实验六石蜡切片（Ⅱ）样品的包埋
11
6
实验七石蜡切片（Ⅲ）石蜡包埋样品的切片、粘片与展片
12
实验八石蜡切片（Ⅳ）石蜡切片样品的染色技术
班级上课时间安排
时间
班级
地点
7～12
周六
8：
30～11：
50
生物30801、02
西1-209
要求：
1、预习：
了解本次实验课的原理及主要内容、操作步骤。
2、写好实验报告：
简写目的、原理、；
详写重要实验步骤；
先思考作业题。
3、带上已写好的实验报告进教室
4、提问：
上课老师提问，根据疑点、难点进行重点讲解。
5、当堂课交报告：
实验做完，完成作业及思考题后交上实验报告。
实验一生物制片样品的选取与固定技术（2h）
一、实验目的要求
了解生物制片样品的选材与固定技术，为石蜡切片做准备。
二、实验原理
1、选材与切割：
根据不同制片目的和制片方法选取合适的材料；
材料要求新鲜，无病虫害；
先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的材料立即固定处理；
材料大小要适当，如根的直径在5mm以内的，可切取5-10mm长的小段，直径在5mm以上者可纵分割成1／2或1／4，横切厚度约3-5mm；
叶的切割可切成2-5mm，若叶较宽可切10mm的长条，叶面切取的部位，以研究者的目的灵活选取。
切取材料必须使用新刀片，刀口和叶面垂直迅速切割下来；
花、果的切割：
花药和雌蕊切割，花芽和幼穗的切割，须剥去外部鳞片及叶鞘和其它部分，切去多余部分再放入固定液，有的花序则需去掉外方苞片，一般小的花不经切割可投入固定掖，大花果才进行分割处理。
2、杀生（杀死）：
在制片过程中，将拟制片的材料（细胞或组织块）迅速杀死，使组织块尽量保持原生活时状态，这种处理通称杀生。
杀生时常用一种或多种化学药品处理。
一般以渗透力较强的药剂作杀生剂效果比较好。
3、固定：
在杀生处理的过程中，将器官、组织、细胞按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，这样才达到固定的要求。
杀生与固定关系密切，通常二者兼有作用。
4、保存：
组织块经杀生固定后，能较长时间保存下来，经久保存下来的组织块，仍能制片，如酒精、醋酸，福尔马林液保存时间较长；
而铬酸类固定液，常须转换70%酒精液后保存，才可较长时间保存。
三、实验材料与试剂
材料：
南瓜茎或禾木植物的茎
试剂：
1、F.A.A固定液（福尔马林－冰醋酸－酒精）
（1）福尔马林（38%甲醛）5mL
（2）冰醋酸5mL（3）70%酒精90mL
2、F.P.A固定液（福尔马林－丙酸－酒精）制片效果有时较F.A.A好。
（1）福尔马林（38%甲醛）5mL
（2）丙酸5mL（3）70%酒精90mL
3、CanoysFluid（卡诺氏固定液）
（1）纯酒精（或95％酒精）15mL
（2）冰醋酸5mL
四、实验操作步骤
1、取样：
用锋利刀片将南瓜茎切成小段，用作横切的切成0.8cm长，用作纵切的切成1cm长，并切去相对两侧少许，最好选择髓腔较大的样品纵切为两半，髓腔较小的样品不用纵切；
2、固定：
用FAA固定24h，抽气，除去材料中的气体，并保存于固定液中；
3、软化：
先经70%、50%、30%酒精及降至蒸馏水（每次瓶装1/3试剂）分别处理2-4h后，置于15%氢氟酸中软化10-15d备用。
氢氟酸可将硅化物软化去除南瓜茎表面的硅化物颗粒，便于制片。
思
考
题
与
参
文
献
思考作业：
1、生物制片如何选择材料？
2、杀生和固定有何意义？
参考文献：
1、王灶安．植物显微技术．北京：
农业出版社，1992
2、李和平．植物显微技术．华中农业大学，2006电子版
3、李正理．植物组织制片学．北京：
北京大学出版社，1996
实验二植物显微化学制片（2h）
掌握植物徒手切片的制作技术与方法。
利用临时装片进行显微化学鉴定，掌握常用植物显微化学实验的原理与方法。
植物显微化学：
将材料以徒手切片方法制成薄片，应用化学反应或染色与化学反应相结合的方法，将组织或细胞内的某种化学成分（淀粉粒、蛋白质、脂肪、果胶质、纤维素及木质素等）在组织切片内予以显示。
用于研究和测定植物的器官、组织及细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布，简便迅速的方法，是野外调查和室内鉴定的极好方法。
土豆
碘-碘化钾溶液：
（1）碘化钾2g；
（2）碘1g；
（3）蒸馏水300mL
配法：
先将碘化钾加热溶于5mL蒸馏水中，然后加入碘，待其溶化后再将溶液稀释至300mL。
四、实验操作步骤
1、制作土豆临时装片：
徒手切片法制作
（1）将材料切成长约2～3厘米的小段，削平切面。
（2）左手的三个指头拿住材料，使之固定不动摇。
为防止刀伤，材料上端应超出手指2～3mm，不可高出过多，否则切片时材料容易动摇，也不容易切薄。
（3）右手大拇指和食指捏住刀片的右下角（刀片要非常锋利，双面刀片必须是新用的），刀口向内，并与材料切面平行，切片前先将材料和刀口上蘸些水，使之切时滑润。
（4）切的方法，以刀口自外侧左前方向内侧右后方拉切，这样可以边切边看清切片的进展情况，同时切起来也比较顺手。
切片时只用臂力而不要用腕力及握刀指关节的力量，左手保持不动，不要两手同时拉动，两手不要紧靠身体或压在桌子上，并且动作要敏捷，材料要一次切下，切忌中途停顿或推前拖后作“拉锯”式切割。
关键是要切得薄而平。
如此连续切片，切下数片后，用湿毛笔将切片轻轻移入培养皿的清水中备用。
（5）在切片过程中刀口和材料要不断蘸水，以保持刀口锋利和避免材料失水变形。
所切的材料和刀片一定要保持水平方向，不要切斜，如果切斜，即使很薄，但由于细胞切面偏斜，同样影响观察。
（6）切下足够多的切片后，挑选薄而平的切片做成临时装片供镜检。
挑选切片时，不一定要材料切得很完整，只要切得很薄就行，有时只要有一小部分就可以看清其结构了。
因此切下的切片不是每一片都适用，也不是只有全面切得薄的才能用，要根据需要进行选择，一次可多选几片置于载玻片上，制成临时装片，通过镜检再进一步选择理想的材料用以观察。
2、染色：
I2-KI溶液染色，取一滴配好的溶液滴在切片材料上染色30S，水洗；
3、观察：
盖上盖玻片置显微镜下观察，可见细胞内含许多被染成蓝色的卵圆形
或椭圆形颗粒，即为淀粉粒。
于高倍镜下观察，可见马铃薯淀粉粒依脐点和轮纹不同有单粒、复粒和半复粒三种类型。
（1）单粒淀粉（图A）：
每粒淀粉有一个脐点，围绕脐点有许多同心环，即轮纹。
（2）复粒淀粉（图B-D）：
每粒淀粉有二个或二个以上的脐点和各自的轮纹，而无共同的轮纹层。
（3）半复粒淀粉（图E）：
每粒淀粉具有二个或二个以上的脐点和各自少数的轮纹，还有共同的轮纹层。
作业
1、碘液染色时间稍长（30s以上）出现黄色为何物质？
2、绘制马铃薯三种类型的淀粉粒图，并引线注明。
备
注
实验三生物样品的非切片制片法－木材解离制片
掌握生物样品的非切片制片法－木材解离制片原理与方法，并观察木质部各组成细胞的形态结构。
不经过切片而是以机械或药物将一部分细胞（或组织）或各个细胞分开的制片法称非切片制片，如用机械法分离叶表皮制片；
用药物解离根尖、茎尖、木材等。
木材
浓硝酸
1、解离将被检查的木质部切成火柴梗粗细，长约1-2cm的小段。
解离方法常有两种，任意选择。
（1）将切好的材料置于试管或烧杯中，加浓硝酸使材料浸没，再加入数小粒氯化钾，水浴（或酒精灯）上加热至有气泡发生并使材料变白为止（为了安全需在排气柜内进行）。
此法解离效果较好。
（2）将切好的材料放于培养皿中，加入过氧化氢一冰醋酸液（以过氧化氢1份+冰醋酸1份配制）密闭后，放置25-30℃温箱（台）中，解离1－2小时，待解离适当转入下一步。
该法解离效果欠佳。
2、水洗：
用尼龙纱网滤去酸液，再换水浸泡数次，尽量除去酸液。
3．保存：
用玻璃棒捣散组织，转入离心管中进行离心处理，或静置沉淀后，吸去上清液，另加入50%酒精保存备用。
4．染色：
取少量木质部解离组织，置1%番红液染5min左右。
5．水洗：
水洗数次去浮色。
（至少3次）
6．粘片：
用玻棒蘸取含有木质部细胞的水液，均匀涂布载玻片上，转置36℃温箱中烘干。
7．封片：
二甲苯过一遍，加拿大树胶封片（可不做）。
8、观察：
解离细胞呈深红色。
作
业
（茎）缘孔纹导管阶纹导管（茎）网纹导管
木质部发达的螺纹导管木质部发达的缘孔纹、螺纹导管
思考题与作业：
绘图并描述导管细胞的形态。
单孔导管
参考文献
实验四细胞组织分离制片法（4h）
掌握组织分离制片原理与方法，并观察表皮细胞的形状及气孔的构造。
学习数码显微照相技术。
以机械或药物将一部分细胞（或组织）或各个细胞分开的制片法，如用机械法分离叶表皮制片。
器材：
生物显微镜、滴瓶、镊子、大方滤纸、培养皿、毛笔、染色缸、载玻片、剪刀、
蚕豆叶
1%番红水溶液；
1%龙胆紫；
无水乙醇；
盐酸；
二甲苯；
FAA固定液
采新鲜无病斑的蚕豆叶或鸭陌草叶，剪去两端及两侧的叶缘一小部分。
用FAA固定材料24h并保存其中。
3、取表皮：
用镊子将已固定的蚕豆叶下表皮轻轻撕下一块，置培养皿的水中，然后用纸（薄道林纸或普通纸张）捞起叶表皮，使其平展于纸上，再用剪刀将纸和表皮剪成3×
3mm的小块，将此小块转移至另一洁净的培养皿水中，待纸与表皮分离，镊出纸块，留表皮于培养皿中。
4、制片：
在载玻片上加1滴蒸馏水，用毛笔挑取一块表皮至水滴中展平，倒去水，待表皮干燥。
5、染色：
1%番红水溶液（或1%龙胆紫）染色1-5min。
6、水洗：
用蒸馏水洗数次，去浮色。
7、分色：
在低倍镜下观察，用盐酸分色（去除浮色）至适度（番红染色可深点）。
8、水洗：
自来水洗数次，洗净酸液，再用蒸馏水过一遍，终止分色。
9、封片：
经无水酒精脱水，3次二甲苯透明，用棉布擦干净。
10、封藏：
在材料上滴一滴二甲苯，再将加拿大树胶滴于其上，用载玻片沿着胶慢慢压下封片。
11、观察：
在显微镜下观察，找到目标视野。
12、拍照：
将数码相机调到微距离拍照档，在自动拍照状态下，照下显微镜中的目标图象。
叶片表皮的双子叶植物
气孔分布
思考题与作业
1、每人制作一张永久片；
2、将观察结果绘图，并表明各部位的名称。
实验五石蜡法制片——样品的脱水、透明与浸蜡（8h）
掌握石蜡制片中脱水、透明和包埋的主要原理与方法。
了解各种透明剂的特点，了解实验中出现问题的原因。
1、脱水：
用的脱水剂去除组织内的水分，并使其组织细胞变硬；
从而使溶解的石蜡顺利进入细胞内，以便进行石蜡切片。
常用脱水剂有：
乙醇（酒精）、二氧六环、正丁醇、叔丁醇、丙酮等药剂。
2、通明：
是制片过程中的基础工作，材料经各级酒精脱水以后，要经过常用的有机溶剂进行透明，这样便于包埋剂（石蜡）及封藏剂（加拿大树胶）进入和溶合。
只有当组织材料全为透明剂所占，并在显微镜下观察呈透明状态时，这种材料才符合制片要求，故透明是制片的重要环节。
常用的透明剂有氯仿，二甲苯等。
3、浸蜡：
在装有材料的纯氯仿瓶中，分次逐步加入纯石蜡蜡片，以石蜡透入细胞组织内的全过程，称为浸蜡。
浸蜡完全的材料，组织块显得十分透明。
氢氟酸处理的南瓜茎
1、苯胺番红酸性染料溶液
（1）苯胺蓝1g
（2）85%或95%酒精100mL
2、无水及不同浓度的酒精溶液
3、纯氯仿
4、石蜡：
软材料用54－56℃熔点的石蜡，若切5μm以下的厚度或炎热夏季切片时，宜用58－60℃的石蜡。
石蜡商标上须注明为“生物组织切片用蜡”字样，选用时还必须检查石蜡细致度、无气泡、无灰尘、无透明点痕、切片时不断裂、不碎等优点。
工业用蜡不能使用。
新石蜡和用后已切碎的石蜡，都必须经过先熔化，然后用3－4层桑皮纸，折叠成漏斗形，进行过滤除去渣滓。
50%石蜡：
一半石蜡和一半二甲苯配制而成；
70%石蜡：
70%石蜡与30%二甲苯配成；
1、整染：
将氢氟酸处理（13d）后的南瓜茎取出，用流水冲洗20h，蒸馏水浸泡洗涤3次，每次2h，然后经苯胺番红整染48h。
2、多级酒精脱水：
经30%、50%、70%、85%、95%及无水酒精处理各2h。
3、多级氯仿透明：
经1/5、2/5、3/5、4/5及纯氯仿通明各2h。
4、浸蜡：
经50%、70%及纯蜡A、B置恒温箱中浸蜡各2h。
包埋时作横切的样品竖放，作纵切的样品卧放。
附步骤及过程表
思考题与作业
脱水、透明对材料的浸蜡与包埋有何影响？
实验五脱水、透明与浸蜡步骤及过程表
天数
时间
步骤
第一天
实验课内
取流水冲尽酸液（自来水冲20h），换蒸馏水冲6h，再用苯胺番红整染48h。
第三天
7：
3030%
9：
4050%
11：
4070%
15：
4085%
19：
4095%
酒精完全浸没材料超过1～2cm
第四天
30
40
无水酒精
无水酒精最好3次，最后1次划格子，共划5格
1/5氯仿
2/5氯仿换软木塞，每次吸出一格，加入一格纯氯仿
3/5氯仿
第五天
304/5氯仿
40纯氯仿
40纯氯仿15：
40碎蜡
同上
全部吸出后，再加纯氯仿
再换1次纯氯仿
第一次加少量碎蜡
第二次加溶液体积的20%36℃恒温
第六天
50%蜡40～42℃
70%蜡48～50℃
纯蜡A再换橡胶塞
纯蜡B56～58℃
纯蜡C63℃石蜡溶化为止
第七天
课内完成
包埋
附
录
一、几种常用的脱水剂及脱水方法
1、乙醇（酒精）（ethylalcohol）乙醇是常用的脱水剂，但因易使组织收缩及发硬，故不是理想的脱水剂。
在配制脱水剂时，用95%酒精配制为15%、30%、50%、70%、85%等各种浓度的酒精。
由低浓度到高浓度按级过渡脱水过程。
一般材料从30%酒精开始，细胞学常以15%酒精开始，有时用与固定液同浓度的酒精开始脱水。
低浓度中不能停留时间太久，否则材料易吸水膨胀，高浓度（在95%无水酒精内）中也不能停留时间过长，否则材料易脆化收缩。
为脱水彻底，在无水酒精中应两次，如果材料转入二甲苯中，有乳白悬浮液出现时，说明脱水不彻底，应退回无水酒精中继续脱水，在脱水进行中，应避免在无水酒精内过夜处理。
2、二氧六环（dioxan）（CH2）4O2又名二氧杂环己烷、氧化二乙烯。
为无色液体，易挥发燃烧，有毒性化合物，不适宜学生实验用，因其毒气是无臭的，吸入后，毒性有积累作用，故开瓶后须十分小心，勿使毒气扩散出。
二氧六环与水及酒精、油类以任何比例混合，其优点：
①兼有脱水和透明作用，不会使组织硬化和收缩，在脱水时，以逐级二氧六环脱水至纯二氧六环后进入石蜡，但其比重大于石蜡，故在进入石蜡前，通过一次氯仿处理驱赶尽二氧六环后再转入浸蜡为好。
②固定液中含有苦味酸的，不必多冲洗即可转入二氧六环中。
③大的材料在浸入二氧六环前，先浸入苯胺油，其结果更好。
④重铬酸钾在二氧六环中不溶解，可在材料中成黄色的染色剂。
⑤浸入冷的二氧六环中，放于冰冻切片机的冻盘上，可冰冻切片。
3、正丁醇（normalbutylalcohol）此剂可与水、酒精、二甲苯等剂混合，也可单独或与酒精配级混合使用，是常用的脱水剂。
为黄色液体，易挥发，吸入后有人会产生头痛，有人则无反应。
其优点：
不会使组织收缩或变硬，能溶解石蜡，可不经透明剂直接浸蜡，脱水时，用正丁醇和酒精配成一定比例，逐级处理至纯正丁醇后，再转移至正丁醇与石蜡等量
混合液中，最后移入包埋蜡杯中，完成包埋工作。
4、叔丁醇（Tertiarybutylalcohol）（简称TBA）是较正丁醇更好的一种脱水剂，可单独用或与酒精混合用；
为无毒性、不会使组织收缩和变脆，还可不经过透明剂，其比重轻，易从石蜡中除去，故可简化脱水、透明、浸蜡等步骤；
因其价格较贵，不宜一般实验用。
熔点为25℃。
具体脱水级别与配法如下（单位：
mL）：
浓度级别1234567891011
95%酒精5111830405050402500
蒸馏水958983705030155000
TBA（叔丁醇）0000102035
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